[發明專利]一種重組融合蛋白及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 200810242790.9
• 申請日: 2008-12-30
• 公開（公告）號: CN101768219A
• 公開（公告）日: 2010-07-07
• 發明（設計）人: 文勇;陳悅;殷曉進;原雪;陳亞利
• 申請（專利權）人: 江蘇先聲藥物研究有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N1/21;A61K38/16;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;劉成群

技術領域

本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種抑制內皮細胞增殖的重組融合蛋白及其制備方 法和在制藥中的應用。

背景技術

迄今為止，癌癥仍為人類健康最大威脅之一，因此抗腫瘤藥物始終是世界各國醫藥 廠商的新藥開發重點。傳統的腫瘤治療方法是針對腫瘤細胞，但在治療過程中，常常由 于腫瘤細胞發生遺傳突變而產生抗藥性，或由于化療藥物的毒副作用導致整個治療失 敗。科學家們一直在追尋治療癌癥的有效方法。上世紀70年代，哈佛大學的佛克曼教 授提出的抗血管生成療法為癌癥的治療找到了一條新的途徑。這一觀點已為大量的研究 結果所證實。以血管為靶點治療腫瘤已成為腫瘤研究的熱點之一，并有多種血管生成抑 制劑進入臨床試驗階段。其中，血管抑制素(angiostatin)和內皮抑制素(endostatin)由于 其作用的特異性、無耐藥性而越來越受到人們的關注。2005年9月， rH-Endostatin(Endostar)獲得我國國家食品藥品監督管理局的批準用于治療非小細胞肺 癌。研究人員發現，來自于endostatin?N端的30個左右的合成短肽，具有與endostatin 一樣的抗腫瘤、抗轉移活性。同樣來自于血纖維蛋白溶酶原，與angiostatin中的Kringlel 具有57.5％同源性的Kringle5對毛細血管內皮細胞的增殖抑制效果好于angiostatin。 Endostatin和angiostatin在腫瘤治療上不僅因為其自身優勢而倍受注目，在不斷的實驗 過程中也逐漸注意到它們的聯合使用更具有協同的抗血管生成作用和抗腫瘤生長作用。 已有的實驗結果表明，endostatin和angiostatin聯合使用對腫瘤生長的抑制作用更為明 顯；同時聯合治療組的抗腫瘤作用比預期的效果強2倍，這進一步表明了endostatin和 angiostatin聯合使用對癌癥生長抑制有協同增效作用。然而由于分別生產endostatin和 angiostatin的成本太高，而且如果直接把endostatin和angiostatin組成一融合蛋白分子量 比較大(分子量約65KD)，二硫鍵過多(13對二硫鍵)，將嚴重影響目的蛋白的產量與 得率，不利于后續的產業化。

發明內容

本發明的目的是提供一種抑制內皮細胞增殖的重組融合蛋白。

本發明的另一個目的是提供所述重組融合蛋白的制備方法。

本發明還有一個目的是提供所述重組融合蛋白在制藥中的應用。

本發明的目的是通過下列技術措施實現的：

一種重組融合蛋白，該重組融合蛋白的氨基酸序列為SEQ?ID?No.2。

編碼所述重組融合蛋白的核苷酸序列，優選核苷酸序列為SEQ?ID?No.1。

一種基因工程菌株，該菌株能表達所述的重組融合蛋白。

所述的重組融合蛋白的制備方法，包括下列步驟：

a.以插入全基因合成片段(編碼所述重組融合蛋白的核苷酸序列)的pMD?18-T為 模板，以SEQ?ID?No.3、SEQ?ID?No.4為上下游引物，進行PCR反應，收集PCR產物；

b.將PCR產物插入表達載體構建重組表達載體，鑒定，將重組載體轉化大腸桿菌；

c.轉化體發酵培養，誘導表達目的蛋白，收集純化目的蛋白。

所述的制備方法，其中表達載體為pET25b。

所述的制備方法，其中誘導劑為乳糖、IPTG。

所述的制備方法，其中純化蛋白采用親和層析法。

所述重組融合蛋白在制備抑制內皮細胞增殖的藥物中的應用，

所述的應用，其中抑制內皮細胞增殖的藥物為腫瘤新生血管抑制劑。

具體來說，本發明技術路線如下：

1、SIMEK基因的設計與獲得