[發明專利]一種血吸蟲感染性釘螺檢測試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 200810242717.1
• 申請日: 2008-12-26
• 公開（公告）號: CN101457258A
• 公開（公告）日: 2009-06-17
• 發明（設計）人: 余傳信;高琪;殷旭仁
• 申請（專利權）人: 江蘇省血吸蟲病防治研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N21/64
• 代理公司: 無錫市大為專利商標事務所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種血吸蟲感染性釘螺檢測試劑盒，其特征是該試劑盒由一套引物混合物，10倍濃縮的環介導等溫DNA擴增反應緩沖液，DNA聚合酶，陽性對照樣本，陰性對照樣本，顯色試劑和樣本DNA抽提試劑組成；

所述的一套引物混合物是由一對外引物和一對內引物組成，其名稱和序列如下：

外引物1：SEQ?ID?NO.2，

外引物2：SEQ?ID?NO.3，

內引物1：SEQ?ID?NO.4，

內引物2：SEQ?ID?NO.5，

所述的一對外引物與一對內引物之間的摩爾數比例為1∶6～9；

所述的DNA聚合酶為具有鏈置換作用的Bst?DNA聚合酶，活性單位為8U/μL；

所述10倍濃縮的環介導等溫DNA擴增反應緩沖液組成是：200mmol三羥甲基氨基甲烷、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、60-120mmol/L硫酸鎂、體積百分1％曲拉通-X100、4～10mol/L甜菜堿和16mmol/L的dNTP；

所述陽性對照樣本為該試劑盒檢測的日本血吸蟲靶DNA片段的重組質粒；

所述的陰性對照樣本為滅菌去離子水；

所述的顯色試劑為10倍濃縮的熒光試劑SYBR?Green?I溶液；

所述的樣本DNA抽提試劑包括：含50mmol/L三羥甲基氨基甲烷、體積百分0.5％Tween-20、pH8.0的樣本裂解液；10mg/mL蛋白酶K；用0.1mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液平衡到pH?8.0的苯酚；氯仿；8mol/L醋酸銨；無水乙醇；70％乙醇；滅菌去離子水。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是一套引物混合物為一對外引物與一對內引物，外引物與內引物之間的摩爾數比例為1∶8；

所述的一套引物混合物的組成是：外引物1、2μmol；外引物2、2μmol；內引物1、16μmol；內引物2、16μmol。

3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是10倍濃縮的環介導等溫DNA擴增反應緩沖液組成，其中硫酸鎂的濃度為80mmol/L，甜菜堿的濃度為8mol/L。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征是試劑盒中陽性對照樣本為日本血吸蟲基因組DNA的PCR擴增產物與TA克隆質粒pGEM-T連結構建的重組質粒，其中含血吸蟲的SEQ?ID?NO.6基因序列；

制備的方法：以所述外引物對日本血吸蟲基因組DNA進行PCR擴增，擴增產物與TA克隆質粒pGEM-T連結構建的重組質粒，轉化大腸桿菌DH5α，抽提質粒DNA，經DNA測序確定含靶DNA片段；紫外分光光度計測定質粒DNA的濃度后再用TE緩沖液稀釋到10ng/μL，即為陽性對照樣本；

TE緩沖液為pH值8.0、含200mmol/L三羥甲基氨基甲烷和1mmol/L四氨基二乙酸。