[發(fā)明專利]一種微囊藻毒素-LR單抗免疫親和柱的制備和使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810242517.6
• 申請日: 2008-12-29
• 公開（公告）號: CN101446576A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙曉聯(lián);肖付剛;湯堅;趙春城;蔡建榮
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省蘇微微生物研究有限公司
• 主分類號: G01N30/50
• 分類號: G01N30/50;G01N30/06
• 代理公司: 無錫市大為專利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時旭丹;劉品超

1.一種微囊藻毒素-LR單抗免疫親和柱的制備方法，其特征是：

(1)用水溶性碳二亞胺法制備微囊藻毒素-LR與牛血清白蛋白BSA偶聯(lián)物，以下簡稱MC-LR-BSA，微囊藻毒素-LR簡稱MC-LR，用MC-LR-BSA作為免疫原，用混合酸酐法制備MC-LR與載體蛋白OVA的偶聯(lián)物，以下簡稱MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作為檢測抗原，通過免疫方法獲得MC-LR單抗；

(2)瓊脂糖凝膠Sepharose?4B的活化：用溴化氰法活化瓊脂糖凝膠Sepharose?4B，活化過程如下：

(a)取10mL?Sepharose?4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分兩次洗滌后抽干，加少量的0.1mol/L?pH8.3的NaHCO₃洗滌，立即轉(zhuǎn)入100mL燒杯中，冰浴下緩慢攪拌；

(b)在通風(fēng)櫥內(nèi)稱取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，邊加邊攪拌，同時測pH值，通過滴加2mol/L?NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反應(yīng)完全，pH保持不變，停止攪拌；

(c)將活化的Sepharose?4B加入小冰塊，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L?pH8.3的NaHCO₃抽洗；

(3)MC-LR單抗免疫親和柱的制備：

將MC-LR單抗與瓊脂糖凝膠Sepharose?4B偶聯(lián)得到的親和吸附劑，填充入柱中得到MC-LR單抗免疫親和柱，簡稱IAC，操作步驟如下：

(d)偶聯(lián)

將制備純化好的MC-LR單抗置于pH8.3含有0.5mol/L?NaCl的0.1mol/LNaHCO₃的偶聯(lián)緩沖液中透析12h；將上述活化好的Sepharose?4B置于砂芯漏斗中用偶聯(lián)緩沖液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR單抗溶液中進行偶聯(lián)，紫外掃描監(jiān)控偶聯(lián)過程；用5倍MC-LR單抗溶液體積以上的偶聯(lián)緩沖液洗去未偶聯(lián)的MC-LR單抗，得到瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物；收集全部的洗脫液，通過測定其蛋白質(zhì)的含量計算未偶聯(lián)上MC-LR單抗的量；

(e)封閉活性基團

將瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物轉(zhuǎn)入5倍體積pH8.0的含0.5mol/L?NaCl的0.1mol/L?Tris-HCl緩沖液中，保持2h，以封閉Sepharose?4B中多余的活性基團；

(f)洗滌

步驟(e)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物依次用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH4.0的含0.5mol/L?NaCl的0.1mol/L醋酸緩沖液和5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的pH8.0的含0.5mol/L?NaCl的0.1mol/L?Tris-HCl緩沖液洗滌，此洗滌過程重復(fù)三次；然后用5倍偶聯(lián)復(fù)合物體積的PBS洗滌兩次；

(g)防腐處理

步驟(f)制備好的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物如需放置一段時間，應(yīng)使用含有1/10000疊氮鈉的PBS緩沖液浸泡，然后瀝去多余的溶液后放入包裝袋或瓶中在4℃密閉保存；

(h)裝柱

將步驟(f)或(g)得到的瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在負壓下用PBS將凝膠壓緊，即制成MC-LR單抗IAC；

(i)保存

瓊脂糖-抗體偶聯(lián)復(fù)合物或填充好的MC-LR單抗IAC切勿冷凍，保存在4℃的冰箱內(nèi)；

(j)IAC的再生

IAC使用后，用4-10個柱床體積pH8.5含0.5mol/L?NaCl的0.1mol/LTris-HCl緩沖液，和用4-10個柱床體積pH4.5含0.5mol/L?NaCl的0.1mol/L醋酸鈉緩沖液輪流清洗IAC兩次，再用PBS緩沖液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱內(nèi)供下次使用。

2.權(quán)利要求1所述方法制備的MC-LR單抗IAC的使用方法，其特征是：

(1)采集的藍藻水華經(jīng)晾曬干燥后，粉碎并過100目篩，干燥藻粉室溫干燥保存；

(2)藍藻樣品前處理

取0.1g干藻粉加20mL?80％甲醇水溶液室溫下置于超聲波細胞破碎儀中提取30min，3000rpm離心10min，收集上層清液，沉淀再重復(fù)抽提兩次，合并上清液并過濾，濾液減壓濃縮至少于1mL，加10mL去離子水稀釋；SPE柱先分別用2mL純甲醇、2mL去離子水預(yù)處理；稀釋后的濾液過SPE柱富集；再分別用5mL去離子水、5mL?10％的甲醇水溶液沖洗SPE柱后用5mL純甲醇洗脫柱上藻毒素；IAC使用前先用2mL純甲醇、2mL去離子水預(yù)處理；洗脫液用甲醇定容至5mL，取10μL，加1mL去離子水后過IAC；IAC用2mL蒸餾水洗后用5mL純甲醇洗脫，洗脫液減壓蒸干，殘留物用1mL甲醇溶解后進LC-MS分析。