[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的試劑盒和檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810241706.1
• 申請(qǐng)日: 2008-12-26
• 公開（公告）號(hào): CN101463395A
• 公開（公告）日: 2009-06-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉湘濤;田宏;吳錦艷;尚佑軍;尹雙輝;靳野
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳市中知專利商標(biāo)代理有限公司
• 代理人: 呂曉蕾

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的試劑盒和檢測(cè) 方法，更具體地涉及RT-PCR一步法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的 試劑盒和檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine?reproductive?and?respiratory syndrome，PRRS)，亦稱藍(lán)耳病，是一種新的有高度傳染性的豬病，主 要表現(xiàn)為妊娠母豬早期流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎以及產(chǎn)弱仔等繁殖障礙 以及各年齡豬發(fā)生呼吸道癥狀，仔豬死亡率高，感染豬出現(xiàn)免疫抑制 等現(xiàn)象。該病最早于1987年在美國(guó)和1990年在歐洲被發(fā)現(xiàn)以來，已 傳遍世界所有養(yǎng)豬國(guó)家，本病隱性感染率高，并呈周期性暴發(fā)。據(jù)統(tǒng) 計(jì)，PRRS每年給美國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成的直接經(jīng)濟(jì)損失為5.6億美元，而 美國(guó)用于該病的防控研究經(jīng)費(fèi)高達(dá)6億美元。因此，國(guó)內(nèi)外許多知名 專家和學(xué)者將該病稱為對(duì)養(yǎng)豬業(yè)最具危害的兩大殺手之一。國(guó)際獸疫 局(OIE)將其列為需要通報(bào)的B類傳染病，我國(guó)亦將其列為二類傳染 病。值得注意的是，自2006年5月份以來，我國(guó)從江西開始發(fā)病， 后波及到浙江、江蘇、安徽、湖南、山東、河南等許多省市，初步估 算，到2007年初，我國(guó)發(fā)病地區(qū)生豬存欄量已銳減了近三分之一， 造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失，也給許多生豬養(yǎng)殖場(chǎng)(戶)造成了毀滅性地打 擊。

國(guó)外和國(guó)內(nèi)均已建立了RT-PCR檢測(cè)方法。國(guó)外應(yīng)用PCR診斷 PRRSV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列， 設(shè)計(jì)了不同引物，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的RT-PCR方法。該方法 直接從PAM分離培養(yǎng)物、臨床樣品(肺泡巨噬細(xì)胞、血清和血漿，肺 臟組織以及精液等)中擴(kuò)增出預(yù)期的片斷，但該方法僅應(yīng)用了一對(duì)引 物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生一個(gè)核苷酸片段。眾所周知，RNA病毒具有 高度變異能力，同時(shí)PRRSV是一種高度傳染性的病毒，因此現(xiàn)有的 檢測(cè)方法不具有快速，敏感和準(zhǔn)確的特點(diǎn)。因此需要研制并開發(fā)出快 速，敏感、準(zhǔn)確以及價(jià)格便宜的PRRSV檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，以 彌補(bǔ)我國(guó)在PRRSV檢測(cè)上的薄弱環(huán)節(jié)，同時(shí)有利于剔除陰性帶毒動(dòng) 物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是快速、敏感、準(zhǔn)確以及低成本地檢測(cè) 豬繁殖與呼吸綜合征病毒。

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一組針對(duì)豬繁殖與呼吸綜合癥病 毒的引物，所述引物包括：

第一對(duì)的上游引物，其序列為SEQ?ID?NO：1；

第一對(duì)的下游引物，其序列為SEQ?ID?NO：2；

第二對(duì)的上游引物，其序列為SEQ?ID?NO：3，

第二對(duì)的下游引物，其序列為SEQ?ID?NO：4；

第三對(duì)的上游引物，其序列為SEQ?ID?NO：5，

第三對(duì)的下游引物，其序列為SEQ?ID?NO：6；

或者上述序列SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：6的向5’端和/或3’端 延長(zhǎng)的序列；

或者與上述序列SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：6同源性大于85％ 的序列；

或者與上述序列SEQ?ID?NO：1至SEQ?ID?NO：6堿基互補(bǔ)的序列。

本發(fā)明還提供了一種用于豬繁殖與呼吸綜合癥病毒的檢測(cè)試劑 盒，所述試劑盒包含RNA酶抑制劑、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、無 RNA酶水、One?Step?RNA?PCR混合液、陰性對(duì)照以及序列SEQ?ID NO：1至SEQ?ID?NO：6引物的混合物。

其中所述One?Step?RNA?PCR混合液包含PCR緩沖液、dNTP和 Mg²⁺。

所述陰性對(duì)照為無RNA酶水空白對(duì)照。

所述陽(yáng)性對(duì)照為為PRRSV?HuN4細(xì)胞株的RNA，其濃度為0.25 μg/mL。

所述RNA酶抑制劑的濃度為40U/μL，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為 5U/μL，Taq酶的濃度為5U/μL，引物的濃度為50pM/μL，One?Step RNA?PCR混合液中PCR緩沖液的濃度為10×，dNTP的濃度為10 mM和Mg²⁺的濃度為25mM。

本發(fā)明還提供了用所述檢測(cè)試劑盒檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合癥病 毒的方法，所述方法包括以下步驟：

a.提取樣品總RNA；