[發明專利]重組逆轉錄病毒載體

有效

• 申請號: 200810240970.3
• 申請日: 2008-12-25
• 公開（公告）號: CN101760475A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 秦志海;呂繼洲;徐迎新
• 申請（專利權）人: 中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/24;C12N7/01;A61K48/00;A61P35/00;A61P35/04
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 王旭

技術領域

本發明涉及一種新型重組逆轉錄病毒載體，其可應用于臨床腫瘤免疫 治療，隸屬于醫學生物技術領域。

背景技術

惡性腫瘤是一種嚴重威脅人類健康的疾病。由于傳統的化學療法、放 射性療法以及手術療法難以治療患有轉移瘤的腫瘤病人，腫瘤免疫學療法 受到免疫學家和醫療工作者的廣泛關注與研究。在臨床治療領域，T細胞 過繼轉移療法作為重要的被動免疫療法已經被成功地應用于血液系統來 源的腫瘤疾病(1，2)。但是對于實體瘤的治療，T細胞過繼療法近年來 進展緩慢，僅有個別報道用該療法治療黑色素瘤患者(3)。目前，T細 胞過繼轉移療法的局限性在于：從腫瘤患者體內分離到的T淋巴細胞數量 不足；其免疫活性、腫瘤特異性不高(4)。目前，臨床上普遍的做法是 在體外培養腫瘤特異性T淋巴細胞過程中加入重組白介素2(5)，但是 其臨床應用的效果不明顯。主要原因如下：白介素2可以引起T淋巴細胞 對于Fas受體介導的凋亡途徑敏感而使特異性的T細胞凋亡(6)；白介 素2還可以促進調節性T細胞的產生從而抑制腫瘤特異性T細胞功能，進 而阻止免疫系統清除腫瘤(7、8)。過繼轉移免疫細胞進入腫瘤病人體內 也有一定風險，即轉入的免疫細胞可能會引起嚴重的自身免疫性疾病以及 T細胞淋巴瘤。這種風險在將白介素2基因或白介素15基因轉染入T細 胞后會有所增加。

因此，為了克服T細胞過繼轉移療法的上述缺點，本發明人進行了本 發明。

發明內容

本發明的目的是為了克服T細胞過繼轉移療法的上述缺點，提供一種 新型重組逆轉錄病毒載體，所述重組逆轉錄病毒載體不但能夠大量擴增腫 瘤患者的T淋巴細胞并保持其腫瘤抗原特異性從而提高治療效果，而且同 時可以清除基因改造過的細胞，避免其在體內增殖所導致的自身免疫性疾 病以及淋巴瘤，確保生物治療的安全性。

因此，本發明提供一種新型重組逆轉錄病毒載體，其特征在于包括人 白介素15基因(SEQ.ID.No.1，全長490bp，NCBI?GeneBank序列登記 號為：NM000585)和胸苷激酶基因(HSV-TK，SEQ.ID.No.3，全長序 列：1131bp，NCBI?GeneBank序列登記號為：AB178228)，以及真核啟動 子hEF1-HTLV序列，其中所述胸苷激酶基因是一種自殺基因。將該重組 逆轉錄病毒載體命名為IL15-TK，本發明人已于2008年12月22日將攜 帶該重組逆轉錄病毒載體IL15-TK的反轉錄病毒TK-L15?Retrovirus保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，中國北京 朝陽區大屯路中科院微生物研究所，100101)，保藏登記號為：CGMCC No.2810。

本發明的重組逆轉錄病毒載體IL15-TK可在體外大量擴增T淋巴細胞 并且保持其腫瘤抗原特異性：該載體可將人白介素15基因導入T淋巴細 胞中，使其自我分泌白介素15刺激自身增殖，同時也可保持其腫瘤抗原 特異性。但是，自我分泌白介素15的T淋巴細胞有可能導致自身免疫性 疾病以及T淋巴細胞瘤，而將自殺基因(胸苷激酶)一同導入T淋巴細胞 能夠避免這種情況發生，從而確保生物醫學治療的安全性。

本新型重組逆轉錄病毒載體IL15-TK含有人白介素15和胸苷激酶基 因，可感染包括人源、鼠源的各種原代細胞(primary?cells)以及細胞系列 (cell?lines)。在載體上強啟動子的作用下，被感染細胞可大量表達白介素 15和胸苷激酶。

在本發明的一個實施方案中，利用含有HSV-TK的重組逆轉錄病毒載 體tgls(+)HyTkEF1a-mIL4(質粒圖譜參見圖1E)(該質粒由德國MDC實驗 室Thomas?Blankenstein博士饋贈，構建方法參見參考文獻16)，酶切去除插 入片段mIL4后載體自連獲得tgls(+)HyTkEF1a(在下文中也簡稱為TK載 體)，在此基礎上構建了本發明的重組逆轉錄病毒載體IL2-TK和IL15-TK， 其中已將攜帶IL15-TK的反轉錄病毒TK-L15?Retrovirus于2008年12月22日 保藏于CGMCC，保藏號為CGMCC?No.2810。本發明人重點研究IL15-TK， IL2-TK作為IL15-TK的功能研究的對照。