[發(fā)明專利]一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810240800.5
• 申請(qǐng)日: 2008-12-23
• 公開（公告）號(hào): CN101760471A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金城;歐陽浩淼;陳曉敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/80
• 分類號(hào): C12N15/80;C12N1/15;C12P21/00;C12R1/68
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

遺傳操作系統(tǒng)是進(jìn)行基因與蛋白質(zhì)功能研究必不可少的。目前已有一些遺傳操作系統(tǒng)可用于煙曲霉，如以乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因pyrG為篩選標(biāo)記的pCDA14。pCDA14轉(zhuǎn)化煙曲霉尿苷/尿嘧啶營養(yǎng)缺陷株CEA17后可在不含尿苷/尿嘧啶的培養(yǎng)基上篩選自養(yǎng)型轉(zhuǎn)化子。雖然該載體還存在轉(zhuǎn)化率和重組率不高的問題，仍是目前研究煙曲霉基因功能的重要手段。但迄今為止還沒有一個(gè)較好的載體系統(tǒng)可用于在煙曲霉中表達(dá)蛋白質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種曲霉表達(dá)載體及其應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的曲霉表達(dá)載體，命名為pchiGFP-S載體，包含原核復(fù)制起點(diǎn)、篩選標(biāo)記基因和外源基因表達(dá)盒；所述外源基因表達(dá)盒從上游至下游依次包括幾丁質(zhì)酶基因啟動(dòng)子、外源基因和終止子。

其中，pchiGFP-S載體的幾丁質(zhì)酶基因啟動(dòng)子和外源基因之間還可含有信號(hào)肽序列。含有信號(hào)肽序列的pchiGFP-S載體命名為pchiGFP載體，pchiGFP載體在宿主菌中表達(dá)的外源蛋白可分泌到細(xì)胞外。所述信號(hào)肽序列具體可為序列表中序列1自5′末端第1704-1817位。所述幾丁質(zhì)酶基因啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可為序列表中序列1自5′末端第1-1703位。所述終止子具體可為構(gòu)巢曲霉的TrpC基因終止子。所述篩選標(biāo)記基因可為氨芐青霉素抗性基因。所述原核復(fù)制起點(diǎn)可為pBR322的復(fù)制起始點(diǎn)。

含有所述載體的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)蛋白的方法。

本發(fā)明所述的生產(chǎn)蛋白的方法，是將所述的表達(dá)載體導(dǎo)入曲霉中獲得重組菌，培養(yǎng)所述重組菌生產(chǎn)目的蛋白。

本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體能夠使外源基因在煙曲霉表達(dá)，且可以無需誘導(dǎo)，利用曲霉生產(chǎn)目的蛋白。本發(fā)明的曲霉表達(dá)載體為煙曲霉基因蛋白功能的研究提供了一個(gè)很好的表達(dá)系統(tǒng)。

附圖說明

圖1為PCR鑒定結(jié)果。

圖2為熒光顯微鏡觀察GFP綠色熒光。

圖3為SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)酵上清液中的GFP蛋白。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1、構(gòu)建煙曲霉表達(dá)載體

一、構(gòu)建pchiGFP表達(dá)載體

提取煙曲霉YJ407?CGMCC?0386(ZL99105415.6)的基因組DNA，基因組DNA的提取方法參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。

設(shè)計(jì)引物ChiG-N和ChiG-C，ChiG-N和chiG-C的核苷酸序列如下：

引物ChiG-N：5’-GGAATTCGAGCCATTGCCTACATCCTTCAC-3’(劃線部分為EcoRI酶識(shí)別位點(diǎn))；

引物ChiG-C：5’-GGGGTACCGCGCGCGCCTCCAGATCAGTAC-3’(劃線部分為KpnI酶識(shí)別位點(diǎn))。

以煙曲霉基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增片段A，片段A包含煙曲霉幾丁質(zhì)酶基因(AfchiB1)的1.5kb啟動(dòng)子(P_chiB1)和N-端信號(hào)肽。

PCR反應(yīng)體系：10×pyrobest?Buffer?5μL，引物ChiG-N和ChiG-C各1μL(20μmol/L)，DNA模板0.5μL(1μg/μL)，dNTPs(各2.5mM)4μL，pyrobestenzyme(TAKARA，5U/μL)0.5μL，最后補(bǔ)水至50μL。

反應(yīng)條件：94℃熱變性3min；94℃變性1min，50℃退火45s，72℃延伸1min30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min。

PCR產(chǎn)物(片段A)用DNA凝膠回收試劑盒回收，方法參考其說明書。

片段A連接到pGEM-T?Easy載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEM-ChiB1，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，對(duì)重組質(zhì)粒pGEM-ChiB1進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明片段A的核苷酸序列如序列表中序列1所示。