[發明專利]一種毛細管和微流控芯片電泳通道中蛋白質的熒光成像表征方法

無效

• 申請號: 200810240104.4
• 申請日: 2008-12-18
• 公開（公告）號: CN101750448A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 汪海林;尹俊發;王智鑫;宋茂勇
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N33/48;G01N21/64
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技術領域

本發明涉及一種毛細管和微流控芯片電泳通道中蛋白質的熒光成像表征方法，用以表征微分離通道中的蛋白質吸附現象和蛋白質涂層材料的性能。

背景技術

毛細管電泳和微流控芯片技術作為基因組學和蛋白質組學研究的一種新技術平臺，受到越來越多的關注。尤其在基因測序和蛋白質分析方面，更是顯示出獨特的應用優勢。

在蛋白質分離過程中，被分離的蛋白質會在石英毛細管或微流控芯片通道內通過靜電吸引而產生吸附，造成樣品濃度變化及毛細管表面能的變化，從而引起峰拖尾和分辨率降低。蛋白質的不可逆吸附，為毛細管電泳和微流控芯片技術用于蛋白質組學的研究帶來一個瓶頸問題。

然而，蛋白質的吸附問題對于具體研究而言也并非是完全不利的因素。隨著人們對蛋白質功能的認識不斷深入，蛋白質越來越多地被用來進行藥物篩選、臨床診斷以及與生命科學相關的相互作用研究。為此，人們通過物理或化學的方法把蛋白質固定到分離通道中，形成具有生物活性的涂層，借以發展適于生化和醫療健康方面研究的新方法和工具。

對非特異性的蛋白質吸附的發生，人們通常通過對電滲流的測定及其穩定性考察等間接手段加以判斷。然而對于蛋白質吸附發生的部位、程度以及這些因素與分離效率間的關系，還沒有很好的方法加以驗證。與之相類似，根據不同的研究目的構建的蛋白質涂層，其性能也多借助電滲流的測定和樣品分離效率來考察，缺乏更為確切、直觀的表征手段。

熒光成像的方法為這一難題的解決提供了可行的實驗思路。本發明采用蛋白質的熒光染料，對吸附在微分離通道內的蛋白質進行染色，將未結合的染料洗去后，在熒光顯微鏡下觀察，用以進行非特異性蛋白質吸附的表征以及蛋白質涂層性能的評價。

發明內容

本發明涉及一種毛細管和微流控芯片電泳通道中蛋白質的熒光成像表征方法。該方法為研究毛細管和微流控芯片電泳通道中蛋白質的不可逆吸附現象提供一種可視化的、操作簡單的表征手段。

本發明的另一目的，在于為蛋白質涂層或者脂質體-蛋白質復合涂層的厚度、均勻性和穩定性的表征提供一種有力的分析方法。

毛細管和微流控芯片電泳通道中蛋白質熒光成像方法，其具體技術方案是：首先，將蛋白質固定到毛細管和微流控芯片電泳通道中，這一過程既可以是在蛋白質的分離過程中發生，也可以是人為地通過物理或化學方法在通道內構建蛋白質涂層；然后，將蛋白質熒光染料充入到微通道內并靜置5-60min，進行蛋白質的熒光染色；接著，用無熒光干擾的溶液或溶劑將未結合的熒光染料洗凈；最后，在熒光顯微鏡上，根據熒光染料的激發波長選定觀測條件，進行成像觀測和圖像分析。全部操作過程在4-37℃條件下進行。

其中，熒光染料是指能夠與蛋白質發生共價或非共價作用并結合的有機熒光染料，包括但不僅限于：熒光素，異硫氰酸熒光素(FITC)，羅丹明B，四甲基羅丹明(TMR)，SYPROOrange，SYPRO?Red，SYPRO?Ruby，吖啶紅，cy3和cy5。

本發明所涉及的方法，在蛋白質的非特異性吸附以及蛋白質涂層的表征方面，具有操作簡單、靈敏度高、直觀形象和快速的優點。

附圖說明

圖1為石英毛細管進樣端吸附蛋白質的熒光顯微鏡圖。

圖2為聚甲基丙烯酸甲酯微流控芯片電泳通道吸附蛋白質的普通光學顯微鏡圖(1)和熒光顯微鏡圖(2)。

圖3為低密度脂蛋白涂層(1)、人血清白蛋白涂層(2)、卵黃蛋白原涂層(3)和無涂層毛細管(4)的熒光顯微鏡圖。

具體實施方式

實施例1石英毛細管上非特異性吸附蛋白質的熒光成像分析

取一支內徑為50μm的熔融石英毛細管(總長31cm，有效長度21cm)，接入Beckman?MDQ毛細管電泳系統，在+15kY電壓、20mM磷酸鹽緩沖液(pH?7.4)、壓力進樣(0.5psi，5s)條件下，連續5次運行0.2mg/mL蛋白質混合樣品(溶菌酶、細胞色素c、核糖核酸酶A和α-糜蛋白酶原A)的分離。操作完成后，將毛細管繼續用20mM磷酸鹽緩沖液(pH?7.4)沖洗10min。