[發(fā)明專利]合成谷胱甘肽的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810239559.4
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN101423814A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱林江;張延平;李寅
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/54;C12P7/16;C12R1/145
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及合成谷胱甘肽的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

丁醇是一種重要的化工原料，主要用于制造增塑劑、溶劑、萃取劑等。近年來發(fā)現(xiàn)丁醇的熱值、辛烷值與汽油相當(dāng)，且能與汽油以任意比混合，可以使用現(xiàn)有的石油管道運(yùn)輸方式，丁醇已成為被世界各國企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)強(qiáng)烈關(guān)注的一種極具潛力的新型生物燃料。通過生物煉制方法生產(chǎn)丁醇已有悠久的歷史，從優(yōu)良菌種的選育到生產(chǎn)工藝和提取工藝的改進(jìn)，都進(jìn)行了大量的研究。但是現(xiàn)有菌株的生產(chǎn)性能(包括轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)量、生產(chǎn)強(qiáng)度和耐極端環(huán)境的能力)還難以滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求。

1861年巴斯德首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌能夠產(chǎn)生丁醇，1912年魏茲曼(Weizmann)發(fā)現(xiàn)了一種梭菌Clostridium?acetobutylicum能夠?qū)⒌矸坜D(zhuǎn)化為丙酮、丁醇及乙醇。迄今，用于丙酮丁醇發(fā)酵生產(chǎn)的最主要的兩株野生菌為C.acetobutylicum?ATCC?824及C.beijerinckii?NCIMB?8052。美國伊利諾大學(xué)Ezeji等對(duì)C.beijerinckii?NCIMB?8052進(jìn)行化學(xué)誘變，篩選獲得丁醇耐受性提高的C.beijerinckii?BA101菌株，在簡單、便宜的培養(yǎng)基中生長較好，適于工業(yè)應(yīng)用。而且該菌株具有良好的傳代穩(wěn)定性，適宜連續(xù)生產(chǎn)。菌株BA101與出發(fā)菌株8052相比，葡萄糖利用率提高明顯，批式發(fā)酵總?cè)軇舛冗_(dá)到3.3％，其中丁醇產(chǎn)量17-21g/L(US?Patent?6,358,717)，是目前國際上報(bào)道的丁醇分批發(fā)酵的最高產(chǎn)量。

決定丁醇成本的核心問題是丁醇的產(chǎn)量、丁醇對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率、以及底物的價(jià)格。因此，對(duì)菌株遺傳改造的研究主要圍繞提高底物的轉(zhuǎn)化率、提高生產(chǎn)菌株對(duì)溶劑的耐受性及選擇更廉價(jià)的底物進(jìn)行。

谷胱甘肽(GSH)是(微)生物中最主要的非蛋白巰基化合物，幾乎在所有的真核生物的細(xì)胞內(nèi)(除了不含線粒體或葉綠體的細(xì)胞)都含有GSH，而在原核生物中，只有少數(shù)幾種能夠合成GSH。在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，GSH的生理濃度在0.1-10mM，除了其具有的典型的抗氧化和維持胞內(nèi)含巰基蛋白的氧化還原平衡功能外，還有報(bào)道GSH具有保護(hù)其它外界環(huán)境對(duì)細(xì)胞的脅迫作用，包括低pH、含氯化合物、高的滲透壓等，并利用對(duì)蛋白質(zhì)的谷胱甘肽化作用，參與翻譯后修飾，改變蛋白質(zhì)功能。一般GSH的合成是分為兩步進(jìn)行：

L-Glu+L-Cys+ATP→γ-Glu-Cys+ADP+Pi????①

γ-Glu-Cys+Gly+ATP→GSH+ADP+Pi????②

GSH在細(xì)菌細(xì)胞中具有重要的生理功能，除具有抗氧化和維持胞內(nèi)巰基的氧化還原平衡外，還提供細(xì)胞的耐受、耐含氯化合物和耐受高滲透壓的功能。另外，提供蛋白質(zhì)的翻譯后修飾功能。在E.coli中，反應(yīng)①和②的兩個(gè)酶分別是由gshA和gshB兩個(gè)基因編碼。另外，在少數(shù)Listeria?spp.和Streptococcus?spp.中具有雙功能的基因gshF，即通過一個(gè)酶的催化完成兩步反應(yīng)，生產(chǎn)GSH。但是相當(dāng)一部分細(xì)菌不能自身合成GSH，許多基因組數(shù)據(jù)分析表明這些細(xì)菌只是含有g(shù)shA的同源基因，在丙酮丁醇梭菌中同樣只含有GSH合成的第一個(gè)同源基因gshA。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種合成谷胱甘肽的梭菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

本發(fā)明所提供的構(gòu)建合成谷胱甘肽的梭菌的方法，是將含有谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的編碼基因的DNA分子導(dǎo)入梭菌中構(gòu)建重組菌。

其中，所述含有谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的編碼基因的DNA分子自上游至下游依此包括硫解酶啟動(dòng)子和谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的編碼基因；所述硫解酶啟動(dòng)子的核苷酸序列具體可如序列表中的序列2所示。

所述含有谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的編碼基因的DNA分子還經(jīng)過甲基化修飾。

所述梭菌為丙酮丁醇梭菌或拜氏梭菌。

所述谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的編碼基因具體可為如下1)至4)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中序列1；

2)其核苷酸序列是序列表中序列3；

3)在嚴(yán)格條件下可與序列表中序列1)或3)限定的DNA序列雜交且編碼谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的DNA分子；

4)與1)或3)的基因具有90％以上的同源性，且編碼谷胱甘肽合成相關(guān)蛋白的DNA分子。

所述丙酮丁醇梭菌為丙酮丁醇梭菌SMB-1?CGMCC?№.2287。

由所述方法構(gòu)建的重組梭菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。