[發明專利]表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用

無效

• 申請號: 200810239474.6
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748077A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 楊貞耐;張莉;王景會;姜媛媛;李玉秋
• 申請（專利權）人: 吉林省農業科學院
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/59;C12N15/81;C12N9/64;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用。?

背景技術

凝乳酶是從未斷奶的小牛皺胃中提取的一種天冬氨酸蛋白酶，它可以切斷κ-酪蛋白導致乳的凝固。凝乳酶主要的生物學功能是水解牛乳中κ-酪蛋白的Phe₁₀₅-Met₁₀₆鍵，導致牛乳凝結，因此被廣泛用于干酪制造業，這個過程應用在干酪生產的第一階段。傳統的凝乳酶通過宰殺未斷奶小牛從皺胃中提取。目前世界年均約5000萬頭小牛被宰殺供提取凝乳酶，由于全球性的小牛短缺使其來源變得不穩定，這種傳統而昂貴的制法已不能滿足世界干酪需求量不斷增長的需要。利用微生物生物工程技術生產凝乳酶可以獲得高純度的凝乳酶，生產成本低，來源穩定。目前美國有70％、英國有90％的干酪是用生物工程凝乳酶生產的。?

我國自80年代就開展了凝乳酶的研究，1988年，譚思元等人研究了凝乳酶原mRNA的分離及其cDNA的克隆，成功分離了poly(A)RNA中含有全鏈長的凝乳酶原mRNA，并通過拼接pCT5及pCT15獲得完整的凝乳酶原基因。中科院微生物所研究了凝乳酶原分子折疊和酶復性(唐兵，楊開宇1997；黎紅曄等1998；陳紅杰等2001)，并通過進一步對大腸桿菌中表達調控的研究，在大腸桿菌中表達了牛凝乳酶(王革等1994)。王志林等(2003)克隆了木瓜凝乳酶基因。?

我國僅有一項關于牛凝乳酶基因工程的技術專利—大腸桿菌中表達外源基因的質粒和牛凝乳酶原的生產方法(ZL95105337X)。在凝乳酶的提取方面，有一項關于從犢牛皺胃中提取凝乳酶的技術專利，一項關于從木瓜中提取蛋白酶的技術專利(CN200410046107.6)。?

畢赤酵母表達系統具有表達量高、能進行蛋白質翻譯后修飾、容易大規模生產、生產成本低、外源蛋白基因遺傳穩定性較好等特點，目前國內外已有數百種外源蛋白基因在畢赤酵母中表達。Pichia.pastoris基因表達系統除了具有一般酵母所具有的特點外，還有以下幾個優點：(1)具有醇氧化酶AOX1基因啟動子，這是目前最強，調控機理最嚴格的啟動子之一；(2)表達質粒能在基因組的特定位點以單拷貝或多拷貝的形式穩定整合；(3)菌株易于進行高密度發酵，外源蛋白表達量高；?(4)畢赤酵母中存在過氧化物酶體，表達的蛋白貯存其中，可免受蛋白酶的降解，而且減少對細胞的毒害作用。目前，在我國尚未見到利用畢赤氏酵母表達牛凝乳酶的報道。?

發明內容

本發明的目的是提供一種表達凝乳酶的畢赤酵母及其構建方法與應用。?

本發明所提供的表達凝乳酶的畢赤酵母，是將凝乳酶基因導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。?

其中，所述凝乳酶基因來源于從小牛皺胃。?

所述凝乳酶基因的核苷酸序列具體是序列表中的序列1。畢赤酵母表達系統具有很高的生物安全性，獲得包括美國FDA在內的廣泛認可。它能夠對外源蛋白進行翻譯后加工，使之更接近于天然蛋白的構象和活性，是一種廣泛應用的真核表達系統。所述畢赤酵母具體可為畢赤酵母GS115。?

本發明的另一個目的是提供一種構建所述重組畢赤酵母的方法，包括如下步驟：?

1)在酵母表達載體的多克隆位點插入凝乳酶基因構建重組酵母表達載體；?

2)將所述重組酵母表達載體導入畢赤酵母中獲得表達凝乳酶的重組菌。?

其中，所述酵母表達載體可為pPICZaA載體。所述畢赤酵母為畢赤酵母GS115。?

本發明構建的表達凝乳酶的畢赤酵母中的一株命名為畢赤酵母DS115/pPICZαA/Chy，畢赤酵母DS115/pPICZαA/Chy(Pichia?pastoris)已于2008年11月12日保藏于中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC，地址為：中國武漢武漢大學)，保藏號為CCTCC?NO.M?208217。?

本發明所述的重組畢赤酵母可用來生產凝乳酶。?

本發明首次在畢赤酵母表達系統中分泌表達了牛凝乳酶，分泌表達無需破碎細胞且培養基中雜蛋白含量極低，純化步驟簡單，適宜工業化生產。畢赤酵母適合于工業規模的高密度發酵，培養基廉價，操作簡單，產物具有很好的生物安全性，適用于食品和醫藥等領域。?

附圖說明

圖1為XhoI和XbaI酶切鑒定重組菌。?

圖2為酵液上清的SDS-PAGE電泳檢測結果。?

具體實施方式

實施例1、表達牛凝乳酶的畢赤酵母

1)牛凝乳酶Chy的克隆?