[發(fā)明專利]一種木聚糖酶編碼基因及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810239321.1
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101418308A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 王春林;曹云鶴;于貴平;李德發(fā);李一航
• 申請（專利權）人: 北京德寶群興科技有限公司
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N15/81;C12N5/10;C12N1/19;C12N15/11;C12N9/42;A23K1/16;C12R1/84
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發(fā)明涉及一種木聚糖酶編碼基因及其應用。

背景技術

木聚糖是由β-1，4-木糖苷鍵連接而成的線狀木糖多聚體，側(cè)鏈上連著多種不同的取代基。在自然界中，木聚糖是第二豐富的半纖維素類多糖，在被子植物中木聚糖占植株干物質(zhì)重的15％～30％，在裸子植物中占植株干物質(zhì)重的7％～12％。木聚糖在動物的消化道內(nèi)不能被消化和吸收，而且會影響其他養(yǎng)分的吸收利用，具有很強的抗營養(yǎng)作用，因而大大地限制了富含木聚糖的飼料(如大麥、小麥和黑麥等)的應用。

工業(yè)上降解木聚糖的方法主要有兩種，即酸解和酶解。酸解作用較快，但常伴隨著有毒物質(zhì)的生成，而且容易引起容器的腐蝕。降解木聚糖的酶類主要是內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶(EC?3.2.1.8)，該酶能將木聚糖分解成低聚糖、木糖和少量的阿拉伯糖。自然界中，除細菌、真菌等微生物能產(chǎn)生木聚糖酶外，藻類、原生動物、甲殼類動物、昆蟲、蝸牛和植物的種子等都可產(chǎn)生木聚糖酶。目前，用于生產(chǎn)實踐中的木聚糖酶主要來自于真菌，因為真菌產(chǎn)生的木聚糖酶能夠分泌到培養(yǎng)基中，易于純化，而且其活性較高。在產(chǎn)木聚糖酶的真菌中，研究較多的是曲霉(Aspergillus?sp.)，到目前為止，已有十幾種曲霉產(chǎn)木聚糖酶的性質(zhì)獲得了深入的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶編碼基因及其應用。

本發(fā)明所提供的木聚糖酶編碼基因可為如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在嚴格條件下可與序列表中序列1限定的DNA序列雜交且編碼木聚糖酶的DNA分子；

3)與1)的基因具有90％以上的同源性，且編碼木聚糖酶的DNA分子。

序列表中的序列1由624個堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5′末端第1-624位堿基，編碼木聚糖酶。

所述木聚糖酶的氨基酸序列如GenBank?Accession?No.DQ168666所示。

上述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃條件下雜交并洗膜。

擴增上述木聚糖酶編碼基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護范圍。

含有上述木聚糖酶編碼基因的重組載體、表達盒、轉(zhuǎn)基因細胞系和重組菌也屬于本發(fā)明的保護范圍。

所述重組載體具體可為在畢赤酵母組成型表達載體pGAPzαA的多克隆位點間插入上述木聚糖酶編碼基因得到的重組載體，如pGAP-xynB。

所述重組菌具體可為在畢赤酵母x-33中導入含有上述木聚糖酶編碼基因的重組載體得到的重組菌。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種制備木聚糖酶的方法。

本發(fā)明所提供的制備木聚糖酶的方法，是發(fā)酵培養(yǎng)上述含有木聚糖酶編碼基因的重組菌，得到木聚糖酶。

上述重組菌可用于制備豬、雞等單胃動物的飼料添加劑，以提高飼料的利用率。

本發(fā)明通過基因工程技術，利用硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBank?Accession?No.DQ168666)和畢赤酵母的密碼子偏好性，合成了一個木聚糖酶編碼基因，并將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母中，從而能高效生產(chǎn)木聚糖酶。搖瓶發(fā)酵研究表明，利用本發(fā)明方法生產(chǎn)的木聚糖酶的產(chǎn)量達到20000U/mL，該木聚糖酶的最適催化溫度為50℃，最適催化pH為4.4，適合作為豬、雞等單胃動物的飼料添加劑使用。

附圖說明

圖1為木聚糖酶基因的重疊PCR擴增結(jié)果

圖2為重組菌株表達產(chǎn)物的SDS-PAGE分析結(jié)果

圖3為木聚糖酶的最適pH值

圖4為木聚糖酶的最適溫度

具體實施方式

實施例1、木聚糖酶編碼基因的重疊PCR法從頭合成

根據(jù)已報道的硫色曲霉木聚糖酶xynB的氨基酸序列(GenBank?AccessionNo.DQ168666)和畢赤酵母的密碼子偏好性，設計8對引物(見表1)，利用重疊PCR方法，擴增木聚糖酶編碼基因序列。

表1?重疊PCR方法擴增木聚糖酶編碼基因的引物序列