[發明專利]用于治療和/或預防小反芻獸疫的siRNA片段及其應用

有效

• 申請號: 200810239186.0
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101748124A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 何宏軒;羅靜;王新衛
• 申請（專利權）人: 中國科學院動物研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/867;C12N15/861;C12N15/86;C12N15/63;A61K31/713;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 曹津燕;郭廣迅

技術領域

本發明涉及一種siRNA片段及其應用，特別是涉及一種用于治療和/或預防小反芻獸疫的siRNA片段及其應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)是由雙鏈RNA介導的序列特異性的基因沉默。1998年2月由華盛頓卡耐基研究院的Fire與馬薩諸塞大學癌癥中心的Mello首次在對秀麗新小桿線蟲(Caenorhabditis?elegan)的研究中提出這一概念，其與在植物中發現的共表達和在粗糙脈孢霉菌中發現的消除(quelling)現象都屬于轉錄后基因沉默機制。這一機制已被證實在真菌、擬南芥、錐蟲、水螅、渦蟲、斑馬魚等幾乎所有真核生物細胞中都存在，甚至在大腸桿菌中也存在類似機制。在發現哺乳動物細胞中也存在這一機制后，RNAi作為一種快速、有效、特異的抑制基因表達的工具被廣泛應用于基因功能的研究以及腫瘤和病毒性疾病的治療研究中。

小反芻獸疫病毒(peste?des?petits?ruminants?virus，PPRV)是副粘病毒科麻疹病毒屬成員，是一種有包膜的不分節段的單負鏈RNA病毒，其病毒粒子呈球形，基因組全長15948個核苷酸，依次包含N-P/C/V-M-F-H-L共6個基因，分別編碼核蛋白(N蛋白)、L蛋白輔助因子(P蛋白)、基本膜蛋白(M蛋白)、介導病毒包膜與宿主細胞膜融合的融合蛋白(F蛋白)、作為受體蛋白與細胞表面分子結合的具血凝素活性的蛋白(H蛋白)、病毒轉錄酶和復制酶的酶成分的蛋白(L蛋白)這六種主要結構蛋白，以及C、V兩種非結構蛋白。所述L蛋白除了具有聚合酶活性外，還有甲基化、加帽和多腺苷酸化的活性，對于PPRV的復制是必需的，在病毒轉錄及復制過程中十分重要。

小反芻獸疫以發熱、眼鼻分泌物、口炎、腹瀉和肺炎為特征，主要引起小反芻動物，尤其是山羊及綿羊發病，患病率與病死率均較高。目前小反芻獸疫在許多國家爆發流行，成為威脅畜牧業安全的重要病原之一。雖然預防PPRV的疫苗有滅活苗和弱毒苗，然而疫苗的使用只能夠提供部分保護，使機體不再出現臨床癥狀，不能阻止再次感染，而且常規疫苗通常需要十四天左右才能對機體產生保護力。另外，弱毒苗毒株在自然狀態下還有可能發生毒力返強現象，造成感染羊群的持續感染，使得一些常規的疫苗很難取得理想的效果。因此，迫切需要開發一種新型的能對所有PPRV病毒株提供更有效保護的抗病毒措施。

發明內容

因此，本發明的目的在于克服現有治療與預防小反芻獸疫方法的上述缺點和不足，提供一種基于RNAi技術的抑制小反芻獸疫病毒基因表達，從而治療和/或預防小反芻獸疫的特異性RNAi片段。

本發明的上述目的是采用以下技術方案來實現的：

一種用于治療和/或預防小反芻獸疫的siRNA片段，其序列為任意一種下列序列：

L-462(SEQ?ID?NO.1)：

5’-GCACAUGCAUAGCUCUCAA-3’

3’-CGUGUACGUAUCGAGAGUU-5’；

L-5389(SEQ?ID?NO.2)：

5’-GCGUACAAGGAAGUUCUUA-3’

3’-CGCAUGUUCCUUCAAGAAU-5’。

上述siRNA片段可以通過化學合成、體外轉錄、siRNA表達載體或siRNA表達框架的方法來獲得。在優選實施方案中，在所述siRNA片段的3’端進一步加上2-6個dT或2-6個U的修飾序列，可以減少siRNA在細胞內降解，增強其穩定性。

按照以下方法將合成的siRNA片段分別轉染至Vero細胞系(非洲綠猴腎細胞)中：

1、Vero細胞的培養：用含10％胎牛血清的RPMI1640培養基(GIBCO)，于37℃、5％CO₂條件下培養；

2、轉染：采用脂質體Hiperfect(Qiagen)進行細胞轉染，用1μgsiRNA轉染Vero細胞(6孔板)。

完成轉染后24h，接種PPRV(MOI＝0.1)進行攻毒。

攻毒24h后，提取細胞總RNA反轉錄，以GAPDH基因作為內參，通過實時定量PCR(Real-time?PCR)檢測PPRV-L基因的mRNA水平，并通過免疫印跡(Western?Blot)檢測PPRV-L蛋白的表達水平。