[發明專利]產紫杉醇亮白曲霉菌及用其制備紫杉醇的方法

有效

• 申請號: 200810236809.9
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101586082A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發明（設計）人: 張鵬;余龍江;周蓬蓬
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12P17/02;C12R1/66
• 代理公司: 華中科技大學專利中心
• 代理人: 曹葆青

技術領域

本發明屬于微生物生物技術、生物制藥領域，具體涉及產紫杉醇亮白曲霉(Aspergillus?candidus)及一株產紫杉醇亮白曲霉HUST-RBB3菌株，以及用其制備抗癌藥物紫杉醇的方法。

背景技術

分離自紅豆杉樹皮的紫杉醇是目前國際上公認的重要抗腫瘤藥物，但由于紅豆杉資源的短缺，導致紫杉醇藥源緊張。微生物發酵法生產紫杉醇是解決紫杉醇藥源問題的最有效途徑之一。微生物發酵生產紫杉醇具有易培養、易控制、生產成本低，可通過優化發酵條件等手段大幅度提高紫杉醇產量等優點，其大規模工業化生產比較容易實現，應用前景廣闊。

自1993年Stierle等首次報道了從太平洋紅豆杉樹中分離到一種可產紫杉醇的內生真菌以來，國內外已有30多種可產紫杉醇的真菌報道。但是，目前發現的產紫杉醇真菌的紫杉醇產量都比較低，首次發現的安德魯紫杉菌(Taxomyces?andreanae)的紫杉醇產率只有24～50ng/L(Stierle?et?al.，1993，Science，260：214-216)。因此，需要提供新的紫杉醇產量高的菌株。

發明內容

本發明的目的在于提供一種產紫杉醇的亮白曲霉及用其制備紫杉醇的方法，該菌種的發明為通過微生物發酵法生產紫杉醇提供了新的菌株。

本發明提供的新的紫杉醇產生菌亮白曲霉HUST-RBB3已于2008年11月10日保藏于中國典型培養物保藏中心(China?Center?for?Type?CultureCollection，CCTCC)，該菌種保藏號為CCTCC?No.M208209，分類命名為亮白曲霉(Aspergillus?candidus)。

本發明的亮白曲霉HUST-RBB3菌株具有以下特征：在25～28℃溫度下，在PDA(potato?dextrose?agar?medium)平板上生長，兩星期后菌落直徑大約1cm，在CYA(Czapek?yeast?autolysate?agar?medium)平板上在可以達到4～5cm，而在37℃不能生長；菌落為白色，有光澤，菌落背面為淺黃色；菌絲直徑約為5～8μm，分枝、有隔；分生孢子大小為2.5～3.5μm、白色、表面光滑、水珠型；具有特征性的孢子頭結構，直徑約為20～50μm，白色，球形；分生孢子梗約600～900μm，頂囊球形或近球形，小梗雙層，在頂囊頭部著生。詳細的形態學特征和生理生化特征見圖1和表1。

上述亮白曲霉HUST-RBB3發酵產紫杉醇可在18～32℃、pH4.0～8.0、需氧條件下進行。該菌株產生的紫杉醇，主要儲藏于細胞中，一部分分泌于細胞外的培養基中。本發明提供的由發酵制造紫杉醇的方法，其特征在于：在培養基中培養亮白曲霉HUST-RBB3菌株以在其細胞內和培養基中聚集紫杉醇后，從其細胞內和培養基中提取紫杉醇。

在溫度為25℃、180rpm振蕩培養的條件下，野生亮白曲霉HUST-RBB3菌株在300ml土豆葡萄糖液體培養基中發酵10天，可以得到大約120μg/L的紫杉醇，是首次發現的產紫杉醇真菌安德魯紫杉菌(Taxomyces?andreanae)的紫杉醇產量(24～50ng/L)的2～5倍，是目前已報道在未優化培養條件下的紫杉醇產量較高的野生菌株。上述土豆葡萄糖液體培養基按下述配比和條件制備：馬鈴薯300g，葡萄糖30g，馬鈴薯去皮，切成塊后用800ml蒸餾水煮沸半小時，然后用紗布過濾，再加葡萄糖，溶化后補蒸餾水至1L，自然pH值，121℃，滅菌15分鐘后使用。

亮白曲霉HUST-RBB3菌株所產紫杉醇已經被本發明人證實，其結構和天然紅豆杉植物中分離、純化得到的紫杉醇標準品完全一致。

附圖說明

圖1為亮白曲霉HUST-RBB3的形態觀察圖，其中，(A)為CYA平板上的菌落，(B)為分生孢子頭(光學顯微鏡鏡)，(C)為分生孢子(電鏡)。

具體實施方式

使用本發明提供的亮白曲霉HUST-RBB3菌株進行發酵培養可以制備紫杉醇，其發酵制備紫杉醇的優化方案為：

(1)將亮白曲霉HUST-RBB3菌株接種在PDA培養基平板上，25℃～30℃靜置培養10～15天后，加入滅菌的蒸餾水，通過玻璃棉過濾器過濾收集孢子，用無菌生理鹽水洗滌3～5次，然后用無菌生理鹽水稀釋至10⁶～10⁸個孢子/ml的數目。