[發(fā)明專利]嘔吐毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒及制備及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810236335.8
• 申請日: 2008-11-07
• 公開（公告）號: CN101413954A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建中;徐祖奇;毛麗華
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫益達(dá)生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 無錫盛陽專利商標(biāo)事務(wù)所（普通合伙）
• 代理人: 顧吉云

1.嘔吐毒素的酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒的制備方法，所述酶聯(lián)免疫吸附檢測專用測試盒，其包括洗滌液、顯色液A、顯色液B和終止液，其還包括包被有嘔吐毒素固相抗原的包被板、嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品、嘔吐毒素（DON）單克隆抗體凍干品以及酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品，其特征在于：其包括以下步驟，包被板的制作、嘔吐毒素DON標(biāo)準(zhǔn)品的制作、嘔吐毒素-牛血清白蛋白DON-BSA偶聯(lián)物的制備、嘔吐毒素-卵清蛋白DON-OVA偶聯(lián)物的制備、抗嘔吐毒素DON單克隆抗體及其溶液的制備、完全福氏佐劑的制備、不完全福氏佐劑的制備、酶標(biāo)記的羊抗鼠抗體凍干品的制備；洗滌液的制備；顯色液A的制備；顯色液B的制備；終止液的制備；所述包被板包被嘔吐毒素固相抗原，其采用96或48或24孔微孔板，用10?mmol／L?~100mmol／L??pH9~10?Na₂CO₃-NaHCO₃的緩沖液作為包被液，將嘔吐毒素-卵清蛋白(DON-OVA)稀釋至0.1μg/m?L?~1.0μg/m?L，96或48或24孔微孔板各孔加100μl，2℃~8℃放置過夜，棄去包被液，洗滌2次~5次，按加入含1%~5%牛血清白蛋白溶于pH?7~8的磷酸鹽緩沖液，2℃~8℃封閉過夜，棄去封閉液，吹干，板條密封后置-20℃~-40℃冷凍保存；所述嘔吐毒素（DON）標(biāo)準(zhǔn)品從嘔吐毒素（DON）純品中稀釋得到，稀釋液為去離子水，DON濃度為：0.001ng/mL?~?1000?ng/mL；嘔吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶聯(lián)物的制備：將DON溶解在吡啶中，在反應(yīng)瓶中加入1一丁基硼酸；混合物在室溫下攪拌過夜，產(chǎn)生7，15一氧一(丁基硼)-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮氣；密封反應(yīng)瓶，混合物在沸水浴中攪拌90分鐘～120分鐘，產(chǎn)生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于5mL乙酸乙酯中，超聲波處理10分鐘~30分鐘后，6000rpm~15000rpm下離心5分鐘~30分鐘，取上清液；將沉淀物用乙酸乙酯溶解，重復(fù)上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(?NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室溫振蕩10?min?~60min，離心；將上清液緩慢滴加到牛血清白蛋白溶于0.01?M?~0.2M?NaHCO₃溶液中，在2℃~8℃振蕩2?hr～3?hr，然后，在0.01?M?~0.2M?磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）pH?7~8中透析，換透析液3次~8次；冷凍干燥，偶聯(lián)物-20℃~-40℃保存；上述反應(yīng)成分的比例為：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐?=?(10~1000)mg?：(30~4000)mg?：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃縮物：NHS：DCC：BSA?=?(10~2000)mg?：(3~1000)mg?：(5-2000)mg：(10-6000)mg；嘔吐毒素-卵清蛋白（DON-OVA）偶聯(lián)物的制備：將DON溶解在吡啶中，在反應(yīng)瓶中加入1一丁基硼酸，混合物在室溫下攪拌過夜，產(chǎn)生7，15一氧一(丁基硼)-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，再在其中加入琥珀酸酐，并通入氮氣，密封反應(yīng)瓶，混合物在沸水浴中攪拌90?分鐘～120分鐘，產(chǎn)生3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；將吡啶在室溫吹干后，加入少量的水，然后將殘余物溶解于乙酸乙酯中，超聲波處理10分鐘～30分鐘后，6000rpm～15000rpm下離心5分鐘～30分鐘，取上清液；將沉淀物用乙酸乙醋溶解，重復(fù)上述操作，合并上清液，將上清液減壓濃縮后備用；取濃縮物與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳化二亞胺（DCC）溶于N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，室溫振蕩10分鐘～60分鐘，離心，將上清液緩慢滴加到卵清蛋白溶于0.01?M?~0.2M?NaHCO₃溶液中，在2℃~8℃振蕩2?hr～3?hr，然后，在0.01?M～0.2M磷酸鹽緩沖液（PBS溶液）pH?7～8中透析，換透析液3次～8次；冷凍干燥，偶聯(lián)物-20℃～-40℃保存；上述反應(yīng)成分的比例為：DON：1一丁基硼酸：琥珀酸酐?=?(10～1000)mg?：(30～4000)mg?：(10-2000)mg，3一氧一半琥珀酰一7，15一氧一(丁基硼)一脫氧雪腐鐮刀菌烯醇濃縮物：NHS：DCC：OVA?=?(10～2000)mg?：(3～1000)mg?：(5-2000)mg：(10-8000)mg?；所述抗嘔吐毒素（DON）單克隆抗體及其溶液的制備：取嘔吐毒素-牛血清白蛋白（DON-BSA）偶聯(lián)物用生理鹽水配成0.1μg/μl~10?μg/μl抗原溶液，與等體積完全福氏佐劑混勻，充分乳化，供首次免疫用，加強(qiáng)免疫時用同量的不完全福氏佐劑代替完全福氏佐劑，首次免疫采用小鼠腹腔內(nèi)直接注射，免疫劑量為10μg/只~100?μg/只小鼠，以后每隔2周~4周加強(qiáng)免疫一次，加強(qiáng)免疫采用尾靜脈注射，免疫劑量10μg/只~100?μg/只，最后一次免疫采用脾內(nèi)注射，4天后取脾融合，將分離的免疫小鼠脾細(xì)胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細(xì)胞SP-2/o以10:1比例混合，離心，去除上清，在50?S～90?S內(nèi)將0.1?ml?~10?ml?50％聚乙二醇分子量為1500加至細(xì)胞中，充分混勻，使其融合，1?min?~3?min后加入10?ml?~50?ml?DMEM培養(yǎng)液，終止融合，水浴靜止10?min?~30?min后離心，去除上清；將融合細(xì)胞用含5％~30％小牛血清的HAT選擇性培養(yǎng)基懸浮后，以最后濃度為1×10⁴~1×10⁶飼養(yǎng)細(xì)胞/0.1?ml接種于以小鼠腹腔巨噬細(xì)胞作飼養(yǎng)層的96孔培養(yǎng)板中，于5％~10%CO₂，35℃~45℃條件下培養(yǎng)，5天~10天后，每培養(yǎng)孔更換2/3?HT培養(yǎng)液，10天～20天后，開始對鏡檢有雜交瘤克隆生長的培養(yǎng)孔，取上清液進(jìn)行篩選，對檢測結(jié)果呈陽性的細(xì)胞立即用有限稀釋法進(jìn)行克隆，雜交瘤篩選采用固相抗原間接非競爭ELISA法進(jìn)行，以嘔吐毒素-卵清蛋白（DON-OVA）為包被抗原，以免疫小鼠的血清為陽性對照，以SP-2/o骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液為陰性對照；陽性細(xì)胞孔的判定標(biāo)準(zhǔn)為（A_試驗-A_空白?）/(A_對照-A_空白)>2.1；對分泌陽性抗體的細(xì)胞進(jìn)行克隆；采用有限稀釋法，將陽性克隆細(xì)胞吹勻，取一微滴至培養(yǎng)瓶內(nèi)，倒置顯微鏡下準(zhǔn)確計數(shù)細(xì)胞個數(shù)，稀釋為70個／m1，再取1?ml稀釋20倍，接種入96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行亞克隆，直至所有細(xì)胞孔的培養(yǎng)上清均呈陽性為止；對10周齡～13周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.3?ml/只～0.5?ml/只，8天～10天后，腹腔注射培養(yǎng)至對數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞，5×10⁵細(xì)胞/只，5?天后注意觀察，收集腹水，離心去除沉淀，加甘油于-20℃~-40℃保存；上述反應(yīng)成分的比例為：DON-BSA?：生理鹽水?=?(10~1000)?μg?：(0.1~10)m1?。