[發(fā)明專(zhuān)利]提高假單胞菌生產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)量的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810235891.3
• 申請(qǐng)日: 2008-11-10
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101519640A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-09-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 童群義;張荊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12N9/90;C12R1/38
• 代理公司: 無(wú)錫市大為專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所
• 代理人: 時(shí)旭丹;劉品超

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高假單胞菌CGMCC?No.2120生產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)量的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

D-甘露糖異構(gòu)酶(D-甘露糖酮醇-異構(gòu)酶，EC5.3.1.7)催化可逆的D-甘露糖與D-果糖的異構(gòu)化反應(yīng)。D-甘露糖是許多多糖和糖蛋白的成分，可用于合成藥物，它還能抑制鼠傷寒沙門(mén)氏菌生長(zhǎng)，可以用作家禽飼料添加劑防止細(xì)菌污染。甘露糖及其衍生物被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、醫(yī)藥等行業(yè)。盡管D-甘露糖的需求量逐漸增加，市場(chǎng)上昂貴的價(jià)格使之不能廣泛的應(yīng)用。因此，用甘露糖異構(gòu)酶將蔗糖，D-果糖轉(zhuǎn)化為一種昂貴的D-甘露糖將會(huì)有利于降低產(chǎn)品成本。?

目前，關(guān)于D-甘露糖異構(gòu)酶的研究多見(jiàn)于外國(guó)報(bào)道，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。1993年，Takasaki等[Takasaki?Y，Hinoki?K，Kataoka?Y，F(xiàn)ukuyama?S，NishimuraN，Hayashi?S，Imada?K(1993)Enzymatic?production?of?D-mannose?from?D-fructoseby?mannose?isomerase.J.Ferment.Bioeng.76：237～239]利用新近從土壤中分離到的假單胞菌MI產(chǎn)生耐熱甘露糖異構(gòu)酶。2003年，Jun?Hirose，Takasaki等[JunHirose，Yuka?Kinoshita，Seijiro?Fukuyama，Sachio?Hayashi，Haruhiko?YokoiYoshiyuki?&?Takasaki(2003)：Continuous?isomerization?of?D-fructose?to?D-mannoseby?immobilized?Agrobacterium?radiobacter.cells?Biotechnology?Letters.25：349～352.]用固定化放射土壤桿菌細(xì)胞將D-果糖連續(xù)異構(gòu)化成D-甘露糖。Ann?Hey-Ferguson等[ANNHEY?FERGUSON，ALAND.ELBEIN(1969).Purification?of?aD-Mannose?Isomerase?from?Mycobacterium?smegmatis.JOURNAL?OFBACTERIOLOGY.101：777～780.]使恥垢分枝桿菌M.Smegmatis細(xì)胞在甘露糖做唯一碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，其細(xì)胞產(chǎn)出甘露糖異構(gòu)酶。但是在這些文獻(xiàn)中都沒(méi)有提到過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件的優(yōu)化。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提出一種優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高假單胞菌CGMCC?No.2120生產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)量的方法，首次報(bào)道了采用單因子實(shí)驗(yàn)、Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡路徑實(shí)驗(yàn)、響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)假單胞菌(Pseudomonas?sp.)CGMCC?No.2120產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：一株產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶的菌株，其分類(lèi)命名為假單胞菌(Pseudomonas?sp.)JN18，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生?物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.2120。?

一種優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基提高假單胞菌CGMCC?No.2120生產(chǎn)D-甘露糖異構(gòu)酶產(chǎn)量的方法：?

菌種：假單胞菌(Pseudomonas?sp.)CGMCC?No.2120；?

培養(yǎng)基以g/L計(jì)為：?

斜面培養(yǎng)基：牛肉膏3，蛋白胨5，瓊脂15，pH7.0；?

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1，酵母膏3，pH7.0；?

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5，酵母膏3，K₂HPO₄2，pH7.0；?

優(yōu)化后的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基：果糖15-16(最優(yōu)為15.26)，牛肉膏20，酵母膏2，K₂HPO₄2，MgSO₄·7H₂O0.5，NaCl0.5，Tween-801.5-1.6(最優(yōu)為1.54)；?

培養(yǎng)方法?

種子培養(yǎng)：取生長(zhǎng)良好的斜面菌種5環(huán)，接種于裝有種子培養(yǎng)基床培養(yǎng)24h。?

發(fā)酵培養(yǎng)：吸取種子發(fā)酵液至裝有適當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，接種量為4％體積分?jǐn)?shù)，30℃振蕩培養(yǎng)48h。?