[發明專利]氨基酸診斷/測定試劑(盒)及氨基酸的濃度測定方法

無效

• 申請號: 200810235671.0
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101762490A
• 公開（公告）日: 2010-06-30
• 發明（設計）人: 王爾中
• 申請（專利權）人: 蘇州艾杰生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/17;G01N33/48;C12Q1/26
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技術領域

本發明涉及一種氨基酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定氨基酸濃度的方法，屬于醫學/食品/環境檢驗測定技術領域。

背景技術

氨基酸含量的測定在醫學/食品/工業/農業/環境中都是比較重要的測定項目。現有的測定方法有色譜法、電化學法、儀器分析法(氨基酸分析儀)、分光光度計等方法，這些方法或是操作方法較為繁雜、特異性差、或儀器設備成本較高等缺點。

氨基酸不是單純的一種物質，用氨基酸分析儀可直接測定出17種氨基酸(儀器價格昂貴，不能普遍使用)，對于醫學/食品/工業/農業/環境中來說，多數情況下，都是很多種氨基酸同時存在，所以需要測定總的氨基酸含量，它們不能以氨基酸百分率來表示，只能以氨基酸中所含的氮(氨基酸氮)的百分率表示。

大量食肉或饑餓時尿中氨基酸氮增加，孕婦及新生兒尿液氨基酸氮也增加。氨基酸代謝異常，造成某些氨基酸在體內積累過多，使尿中氨基酸氮增高；急性肝萎縮、肝功能衰竭、Reye綜合征、或某些因素造成蛋白質分解加速的疾病，遺傳性疾病所導致的代謝異常均可使尿中氨基酸氮增加。

酶法測定血、尿、體液、食品、土壤、工業產品中氨基酸氮含量具有特異性高、方法簡便、成本低的特點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提出一種利用間接酶循環擴增法(IndirectEnzymatic?Recycling?Method)、酶比色法(Enzymatic?Colorimetric?Method)及酶(偶)聯法(Couple?Reaction)技術，計量/連續監測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在340nm波長處吸光度的變化，得以測定氨基酸濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的氨基酸診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行氨基酸濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。

本發明氨基酸濃度測定方法如下：

氨基酸+水+氧氨基酸氧化酶氧代酸+氨+過氧化氫

氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶K⁺??色氨酸+水

色胺酸+輔酶色胺酸脫氫酶/Ca²⁺(吲哚-3-基)丙酮酸+氨

+還原型輔酶

這種方法應用氨基酸氧化酶(amino-acid?oxidase；EC?1.4.3.2；EC?1.4.3.3)酶(偶)聯色氨酸酶(tryptophanase；EC?4.1.99.1)、色氨酸脫氫酶(Tryptophandehydrogenase；EC?1.4.1.19)酶促反應連續監測法。氨基酸氧化酶及色氨酸酶作為作用酶，功能為將氨基酸酶解產生氨再生成色氨酸。色氨酸脫氫酶作為循環酶：色氨酸脫氫酶的酶促作用使色氨酸再次生成氨，使氨不斷地被重復循環利用。色氨酸脫氫酶又作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的速度，可以測算出氨基酸的濃度。鉀離子及鈣離子分別激活色氨酸酶及色氨酸脫氫酶活性。

實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發明氨基酸診斷/測定試劑(盒)較為理想：

緩沖液????????100mmol/L

穩定劑????????500mmol/L

輔酶??????????3mmol/L

氨基酸氧化酶??10000U/L

色氨酸酶??????12000U/L

色氨酸脫氫酶??12000U/L

丙酮酸????????12mmol/L

吲哚??????????6mmol/L

氯化鉀????????5mmol/L

氯化鈣????????4mmol/L

本發明的氨基酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括：

緩沖液、穩定劑、輔酶、氨基酸氧化酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、丙酮酸、吲哚、氯化鉀、氯化鈣。

試劑(盒)可以是干粉狀態，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，直接使用。

也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑：

試劑1