[發明專利]檢測ChIFN-γ的雙單克隆抗體夾心ELISA方法

無效

• 申請號: 200810235438.2
• 申請日: 2008-11-25
• 公開（公告）號: CN101441220A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發明（設計）人: 焦新安;戴華;鄭佳玉;陳俊華;潘志明;陳祥;孫林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/543
• 代理公司: 南京知識律師事務所
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明屬于免疫學檢測方法領域，具體涉及檢測家禽細胞因子的雙單克隆抗體夾心ELISA方法。

背景技術

γ-干擾素(IFN-γ，又稱作免疫干擾素或II型干擾素)是細胞免疫應答的重要媒介，在機體免疫應答調節方面具有重要功能，尤其對誘導及維持Th1細胞免疫應答具有重要作用。Th1應答對抵抗胞內病原的感染非常重要，而IFN-γ分泌性T淋巴細胞的出現是Th1應答的標志。生物樣品中IFN-γ的水平及IFN-γ分泌細胞的出現通常作為評價Th1免疫應答發生的標志。

目前檢測細胞因子的方法很多，主要有生物活性測定法、免疫學檢測法，利用核酸標記技術檢測細胞因子等。但在復雜的生物樣品中，對既定的細胞因子的功能分析很多情況下并不能反映其實際的功能。如，在保護細胞抵抗病毒感染的作用方面，I、II?IFN均具有這種功能，盡管這兩類IFN的結構并不是非常密切相關的，且由不同的細胞所分泌，但如果僅從功能上進行分析，并不能準確反映特定細胞因子的實際情況。而且，對特定的細胞因子而言，其活性半衰期很短，導致對其功能的分析不再能進行，盡管在樣品收集時，這些細胞因子是存在的，在蛋白質水平上仍能分析，但由于其活性的半衰期很短，導致功能上的分析不再能進行。Northern?blot，RNase?protection及PCR等基因分析方法均高度敏感，且與目的基因完全匹配，但其只能停留在基因轉錄水平上的分析，很多信息是難以捕獲的。

因此，急需一種能夠定性和定量檢測生物樣品中IFN-γ的檢測方法。尤其是針對胞內菌、寄生蟲、病毒及其它病原引起的胞內感染，快速有效的細胞因子檢測工具及檢測方法對這類疾病的檢測和診斷非常有益。目前，由于缺乏有效的檢測工具及檢測方法，對疾病條件下免疫狀態的分析及評價很困難，為了改善這種現狀，人們進行了許多努力，如生產重組細胞因子，研制特異性抗細胞因子mAb改進檢測方法。

隨著單克隆抗體技術的發展，檢測細胞因子的酶聯免疫吸附捕獲方法(ELISA)得到了大力的發展。在其他的物種中，ELISA得到了很大的發展，并且被證明是一種非常穩定、可信、簡單、易行的細胞因子檢測方法，可用于檢測經活化釋放的細胞因子，因而，人們認為該方法是評價細胞免疫應答(CMI)的很好的指示方法。而且，這種檢測方法是多用途的，不但可以用于檢測絲裂原或許多病原再次刺激誘導的CMI，而且可用于檢測免疫后激發的CMI。

雞在大量的家禽胞內感染疾病方面是一個重要的動物模型，到目前為止，選擇雞作為家禽疾病的動物模型受到了許多限制，主要是因為缺乏適當的檢測工具和檢測系統。1995年Digby等成功克隆、表達出ChIFN-γ基因，對ChIFN-γ的研究蓬勃開展，其功能研究工作也在進行當中。2000年，Cheol?H.等利用天然的或重組的ChIFN-γ研制出抗ChIFN-γmAb，并建立了直接ELISA方法檢測艾美爾球蟲感染雞的血清ChIFN-γ水平；隨后，B.Lambrecht等利用基因槍免疫法制備出抗ChIFN-γmAb，并運用純化的抗ChIFN-γ多抗作為捕獲抗體，生物素標記的mAb作為檢測抗體，建立了檢測ChIFN-γ的雙抗體夾心ELISA方法。本發明采用原核表達的重組ChIFN-γ為免疫抗原及檢測抗原，制備出抗ChIFN-γmAbs，運用純化的抗ChIFN-γmAb作為捕獲抗體，生物素標記的mAb作為檢測抗體，建立檢測生物樣品中ChIFN-γ的雙單抗夾心ELISA方法，該方法避免了運用多抗作為捕獲抗體，保證了包被抗體的穩定性和均一性，因為不同批次制備出的多抗可能存在很大的差異，較難標準化，而mAb細胞株的優越性在于可以無限量地生產出具有均一特性的mAb。

ChIFN-γ抗原捕獲ELISA可以在蛋白質水平上對ChIFN-γ進行評價，較生物學方法更為簡便、實用、靈敏，便于操作和大面積使用。該方法的建立為檢測雞CMI提供靈敏的檢測工具。而且，該方法將有利于研究ChIFN-γ在家禽的不同的免疫應答機制中的作用。

發明內容

本發明的目的在于建立一種簡捷、實用、靈敏、高效的檢測ChIFN-γ雙單克隆抗體夾心ELISA方法。

本發明的技術方案是：檢測ChIFN-γ的雙單克隆抗體夾心ELISA方法，是：采用抗ChIFN-γ特異性mAb試劑，建立檢測ChIFN-γ特異性雙mAb夾心ELISA方法。該方法以mAb3E5作為捕獲抗原，以生物素標記的mAb3E3作為檢測抗體，建立檢測ChIFN-γ的雙mAb夾心ELISA方法。該方法可以靈敏地檢測到微量的ChIFN-γ。

上述方法具體的步驟是：