[發明專利]禾谷鐮孢菌鑒定及其對多菌靈產生中等抗藥性水平確認的一管檢測法

無效

• 申請號: 200810235087.5
• 申請日: 2008-11-17
• 公開（公告）號: CN101475983A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 陳長軍;周明國;王建新
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發明是禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對多菌靈產生中等抗藥性(即，中抗)水平確認一管(即，在一個PCR反應管中)檢測法，屬于植物病原菌抗藥性亞群體的檢測方法，專用于檢測抗多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的禾谷鐮孢菌。?

二、技術背景?

小麥赤霉病是由禾谷鐮孢菌(Gibberella?zeae，無性態Fusarium?graminearum)引起的一種世界性病害，嚴重影響小麥的產量和品質。長期以來采用苯并咪唑類殺菌劑或以這類藥劑為主的復配劑進行化學防治。苯并咪唑類殺菌劑作為一類高效、廣譜內吸性殺菌劑在生產上應用，解決了保護性殺菌劑的環境毒性問題，提高了人類控制該病害的能力。苯并咪唑類殺菌劑包括多菌靈、苯菌靈、噻菌靈、甲基硫菌靈等。這些殺菌劑具有相同的抗菌譜和抗菌機制，它們也具有相同的抗藥性機制，相互之間存在正交互抗藥性。由于這類藥劑的高度專化性，作用位點單一，加上施用頻率高，使用20年后許多植物病原真菌群體中就會出現抗藥性亞群體，使藥劑防治完全失去效果。對苯并咪唑類藥劑的殺菌機制和抗藥性機制研究表明，藥劑主要是結合在病菌的β-微管蛋白上從而阻止細胞的有絲分裂，達到抑制病菌生長的目的。已有的對幾種植物病原菌的分子生物學研究表明，病菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性自然突變體主要是其β-微管蛋白196～202位氨基酸的改變，這些改變使該蛋白質的三維構象發生改變，從而阻止了藥劑與靶標結合，使病菌表現抗藥性。在人工誘變菌株中除上述位點外還涉及其它一些位點，如165，257等的氨基酸變異。通過定點突變也確認了198和200位氨基酸類型與抗感性密切相關。但是禾谷鐮孢菌對多菌靈的抗藥性機制并非像其它絲狀真菌一樣由β-微管蛋白198位等氨基酸突變所致。?

早期檢測病原群體中抗藥性亞群體/抗藥性基因的頻率，及早實施抗藥性治理策略，是延緩抗藥性亞群體的發展，防止抗藥性病害流行危害最有效的措施。傳統的檢測方法需要分離培養病原菌，然后在含藥培養基上培養，再根據藥劑對菌絲生長的效應鑒別抗藥性。這種對藥劑的敏感性測定方法通常需要幾周時間，工作量大，測定樣本數量有限，難以早期發現抗藥性亞群體的存在，也不能用于當年的抗藥性短期預測。在抗藥性機制研究基礎上，根據基因點突變的原理，應用核酸技術如寡核苷酸一聚合酶鏈式反應(ASO-PCR技術)等檢測病原真菌對多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性，則能快速、準確檢測大量樣本，使在早期檢測低頻率的抗藥性基因成為可能。?

三、發明內容

技術問題??本發明的目的在于提供禾谷鐮孢菌鑒定及其是否對多菌靈產生中等抗藥性水平的一種快速檢測方法。針對禾谷鐮孢菌抗多菌靈的檢測基因設計特異性引物檢測，有時會因其他植物病原菌與該基因非特異性結合而誤判。現有研究中尚沒有在一個聚合酶鏈式反應(polymerase?chainreaction，簡稱PCR)體系中，同時評價待測樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對多菌靈產生中斷抗藥性水平的方法。?

技術方案??提取的基因組DNA或病粒可直接用于ASO-PCR禾谷鐮孢菌對多菌靈中抗水平菌株的基因檢測，其β2-微管蛋白基因，長度為1713bp，相應的編碼β₂-微管蛋白的447個氨基酸，檢測基因包含中抗菌株β2-微管蛋白基因編碼的第167位氨基酸的抗藥性突變位點Phe(TTT)密碼字突變為Tyr(TAT)密碼字。編碼167位氨基酸的密碼子發生點突變導致對多菌靈的中等抗藥性水平，占田間突變類型的99.5％。?

(1)設計特異性的引物檢測禾谷鐮孢菌；?

(2)設計特異性的引物檢測對多菌靈中等抗性的引物；?

(3)在一個聚合酶鏈式反應(polymerase?chain?reaction，簡稱PCR)體系中(即，在一個PCR反應管中)，同時加入特異性檢測禾谷鐮孢菌種類和多菌靈抗藥性水平的兩對引物，在同一個PCR反應程序控制下與待測樣品的核基因組結合，擴增，電泳檢測，可同時評價待測樣品是否為禾谷鐮孢菌及其是否對多菌靈產生中等抗藥性水平。?

有益效果??本發明禾谷鐮孢菌鑒定及其對多菌靈產生中等抗藥性水平確認一管檢測法，具有如下優點和積極效果：?