[發明專利]豬源大腸桿菌中抗四環素基因tet(B)的PCR檢測方法

無效

• 申請號: 200810233791.7
• 申請日: 2008-12-31
• 公開（公告）號: CN101560552A
• 公開（公告）日: 2009-10-21
• 發明（設計）人: 侯春;張智輝;孫放;貢嬌娜;竇秋燕
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一種豬源大腸桿菌中抗四環素基因tet(B)的PCR檢測方法，屬檢測技術領域。

背景技術：

長期以來抗菌劑(包括抗生素，硫酸銅等)被作為生長促進劑添加到飼料中，在增加動物養殖效益的同時導致高頻率的抗生素抗性細菌的出現，這些抗性細菌攜帶的抗性基因可以被轉移到在人類致病菌，這是對人類健康的潛在威脅。Aarestrup等推測禁止使用抗生素作為生長促進劑添加到豬飼料中后，在養豬場抗生素抗性細菌仍然保持高發生率的原因可能是由于銅仍然被添加到豬飼料中作為生長促進劑，它們選擇抗生素抗性細菌并維持了它們的發生率(Aarestrup，F.M.，H.Hasman，L.B.Jensen，et?al.2002.Antimicrobial?resistance?among?enterococcifrom?pigs?in?three?European?countries.Appl.Environ.Microbiol.68：4127-4129.)。鏈霉素抗性基因strA和strB廣泛存在與人體、動物體、和植物體的正常菌群和病原菌中(Sundin，G.W.，Monks，D.E.&?Bender，C.L.Distribution?of?thestreptomycin-resistance?transposon?Tn5393?among?phylloplane?and?soil?bacteria?frommanaged?agricultural?habitats.Can?J?Microbiol?41，792-799.)，四環素抗性基因tet(B)也是一個在革蘭氏陰性細菌中常見的抗性基因(Roberts，M.C.Update?on?acquiredtetracycline?resistance?genes.FEMS?Microbiol?Lett?245，195-203.)。這三個基因常被作為抗生素抗性基因的代表來進行檢測。

目前我國的豬飼養業仍然在飼料中添加抗生素和銅鹽、鋅鹽作為生長促進劑，這必然對豬肉產品安全造成威脅。快速檢測豬源大腸桿菌中是否存在抗性基因對評價豬肉產品安全具有重要意義。而常規PCR檢測程序需要從細胞中提取DNA樣品，耗時長，試劑消耗多，造成檢測樣品周期長成本高。本發明采用豬源大腸桿菌單菌落直接做DNA模板，實現了用PCR方法快速、經濟地檢測豬源大腸桿菌中的抗四環素基因tet(B)。

經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。

發明內容：

本發明的目的在于克服現有檢測方法之不足，而提供一種能快速檢測豬源大腸桿菌中抗四環素基因tet(B)的PCR檢測方法。

本發明的檢測方法包括：用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備；抗四環素基因tet(B)的引物序列；PCR反應液組成；PCR擴增反應條件；及PCR擴增產物的檢測方法。

其中，用于PCR檢測的豬源大腸桿菌單菌落培養物的制備方法：將分離到的待檢測的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養基平板上，37℃培養18-36h，得到單菌落。

抗四環素基因tet(B)的引物序列為：上游：5’CCTTATCATGCCAGTCTTGC?3’；下游：5’ACTGCCGTTTTTTCGCC?3’；PCR擴增產物大小為：774bp。

PCR反應液組成：(1)10x?PCR?buffer，(2)10μM上游引物序，10μM下游引物序，(3)10μM?dNTP，(4)用一個無菌的0.5-10μL移液槍頭挑取一個單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應液中混勻，(5)1.5-3.0U?Taq酶，(6)反應體系20-50μL。

PCR擴增反應條件：94℃預變性5-10min；94℃變性0.5min、50℃退火0.5min、72℃延伸1.5min、共進行30-35個循環；72℃延伸10min，于4℃下保存。

PCR擴增產物的檢測方法：將擴增產物于0.8-2.0g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測及UV?I凝膠成像分析結果。

本發明與現有技術相比，具有較好的特異性，能在5h內完成對豬源大腸桿菌樣品是否帶有抗四環素基因tet(B)的檢測，檢測方法快速、簡便、且經濟。本發明為評價豬肉食品安全提供了一個技術手段，有良好的運用前景。

附圖說明：

圖1為本發明方法檢測健康豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗四環素基因tet(B)的電泳圖，其中：

M：分子量標準

1：抗銅大腸桿菌菌株W2a6

2：抗銅大腸桿菌菌株W2a51

3：抗銅大腸桿菌菌株W1c4