[發(fā)明專利]豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的PCR檢測(cè)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810233790.2
• 申請(qǐng)日: 2008-12-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101560551A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-10-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯春;張智輝;孫放;貢嬌娜;竇秋燕
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 楊宏珍

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的PCR檢測(cè)方法，屬檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來(lái)抗菌劑(包括抗生素，硫酸銅等)被作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加到飼料中，在增加動(dòng)物養(yǎng)殖效益的同時(shí)導(dǎo)致高頻率的抗生素抗性細(xì)菌的出現(xiàn)，這些抗性細(xì)菌攜帶的抗性基因可以被轉(zhuǎn)移到在人類致病菌，這是對(duì)人類健康的潛在威脅。Aarestrup等推測(cè)禁止使用抗生素作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑添加到豬飼料中后，在養(yǎng)豬場(chǎng)抗生素抗性細(xì)菌仍然保持高發(fā)生率的原因可能是由于銅仍然被添加到豬飼料中作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，它們選擇抗生素抗性細(xì)菌并維持了它們的發(fā)生率(Aarestrup，F(xiàn).M.，H.Hasman，L.B.Jensen，et?al.2002.Antimicrobial?resistance?among?enterococcifrom?pigs?in?three?European?countries.Appl.Environ.Microbiol.68：4127-4129.)。鏈霉素抗性基因strA和strB廣泛存在與人體、動(dòng)物體、和植物體的正常菌群和病原菌中(Sundin，G.W.，Monks，D.E.&Bender，C.L.Distribution?of?thestreptomycin-resistance?transposon?Tn5393?among?phylloplane?and?soil?bacteria?frommanaged?agricultural?habitats.Can?J?Microbiol?41，792-799.)，四環(huán)素抗性基因tet(B)也是一個(gè)在革蘭氏陰性細(xì)菌中常見(jiàn)的抗性基因(Roberts，M.C.Update?on?acquiredtetracycline?resistance?genes.FEMS?Microbiol?Lett?245，195-203.)。這三個(gè)基因常被作為抗生素抗性基因的代表來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

目前我國(guó)的豬飼養(yǎng)業(yè)仍然在飼料中添加抗生素和銅鹽、鋅鹽作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑，這必然對(duì)豬肉產(chǎn)品安全造成威脅。快速檢測(cè)豬源大腸桿菌中是否存在抗性基因?qū)υu(píng)價(jià)豬肉產(chǎn)品安全具有重要意義。而常規(guī)PCR檢測(cè)程序需要從細(xì)胞中提取DNA樣品，耗時(shí)長(zhǎng)，試劑消耗多，造成檢測(cè)樣品周期長(zhǎng)成本高。本發(fā)明采用豬源大腸桿菌單菌落直接做DNA模板，實(shí)現(xiàn)了用PCR方法快速、經(jīng)濟(jì)地檢測(cè)豬源大腸桿菌中的抗鏈霉素基因strB。

經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測(cè)方法之不足，而提供一種豬源大腸桿菌中抗鏈霉素基因strB的PCR檢測(cè)方法。

本發(fā)明的檢測(cè)方法包括：用于PCR檢測(cè)的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備；抗鏈霉素基因strB的引物序列；PCR反應(yīng)液組成；PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法。

其中，用于PCR檢測(cè)的豬源大腸桿菌單菌落培養(yǎng)物的制備方法：將分離到的待檢測(cè)的豬源大腸桿菌菌株劃線接種在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)18-36h，得到單菌落。

抗鏈霉素基因strB的引物序列為：上游：5’GACTCCTGCAATCGTCAAGG?3’；下游：5’GCAATGCGTCTAGGATCGAG?3’；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為：560bp。

PCR反應(yīng)液組成：10x?PCR?buffer，10μM上游引物序，10μM下游引物序，(3)10μM?dNTP，用一個(gè)無(wú)菌的0.5-10μL移液槍頭挑取一個(gè)單菌落(作為DNA模板)放入PCR反應(yīng)液中混勻，1.5-3.0U?Taq酶，反應(yīng)體系20-50μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5-10min；94℃變性1min、55℃退火1min、72℃延伸2min、共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，于4℃下保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法：將擴(kuò)增產(chǎn)物于0.8-2.0g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)及UV?I凝膠成像分析結(jié)果。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有較好的特異性，能在5h內(nèi)完成對(duì)豬源大腸桿菌樣品是否帶有抗銅基因pcoA的檢測(cè)，檢測(cè)方法快速、簡(jiǎn)便、且經(jīng)濟(jì)。本發(fā)明為評(píng)價(jià)豬肉食品安全提供了一個(gè)技術(shù)手段，有良好的運(yùn)用前景。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明方法檢測(cè)健康豬源抗銅大腸桿菌菌株中抗鏈霉素基因strB的電泳圖，其中：

M：分子量標(biāo)準(zhǔn)

1：抗銅大腸桿菌菌株W2a6

2：抗銅大腸桿菌菌株W2a51

3：抗銅大腸桿菌菌株W1c4

4：抗銅大腸桿菌菌株W1c12