[發(fā)明專(zhuān)利]葉綠體型谷氨酰胺合成酶基因的植物表達(dá)載體及其構(gòu)建和應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810233624.2
• 申請(qǐng)日: 2008-11-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101413011A
• 公開(kāi)（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李昆志;王藝霖;陳麗梅;趙艷;傅冰;潘麗峰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 昆明理工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/82
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/82;C12N15/52;A01H1/00
• 代理公司: 昆明今威專(zhuān)利代理有限公司
• 代理人: 賽曉剛

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物工程領(lǐng)域，具體涉及一種葉綠體型谷氨酰胺合成酶基因GS2的植物表達(dá)載體pK2-35S-Prbcs-*T-GS2，其構(gòu)建方法及其在轉(zhuǎn)基因作物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

氮是植物需求量最大的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，同時(shí)，又是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育最受限制的營(yíng)養(yǎng)元素之一(Jones等，2005，Soil?Biology?and?Biochemistry，37：413—423)。為了獲取盡可能多的、為生長(zhǎng)發(fā)育所需的氮，植物形成了幾種獲取氮的途徑：土壤氮的吸收、大氣氮?dú)獾墓潭?豆科植物)、干濕沉降氮的吸收、捕食昆蟲(chóng)等，對(duì)于一般植物(非豆科植物)，主要依靠吸收土壤中的氮來(lái)維持生理活動(dòng)。但是土壤中的氮難以滿足作物生長(zhǎng)發(fā)育的需求，因此在生產(chǎn)中，廣泛采用施用氮肥的方法來(lái)滿足作物的需要。但是施用的氮肥卻由于氨揮發(fā)、硝態(tài)氮流失和反硝化脫氮等原因，使其利用率很低，當(dāng)季氮的利用率全國(guó)平均不足30％，這不但直接導(dǎo)致效益降低，同時(shí)還造成土壤和水源污染，對(duì)人們賴(lài)以生存的環(huán)境造成危害。因此，施用化肥并不是滿足作物生長(zhǎng)需求的最佳辦法，而應(yīng)該考慮遺傳學(xué)方法，提高植物本身對(duì)土壤環(huán)境逆境的適應(yīng)性(Clark?R?B等，1991，F(xiàn)ield?Crop?Res?27：219-240)。但是由于高氮利用率這一性狀在大田條件上難以評(píng)價(jià)，因此采用傳統(tǒng)育種方法來(lái)選育高氮利用率的作物品種大都很難成功，所以，通過(guò)基因工程方法，提高植物自身的氮素同化能力，成為一種最自然、最環(huán)保的方式。

植物吸收的氮主要有兩種形式，無(wú)機(jī)氮(硝態(tài)氮和銨態(tài)氮)和有機(jī)氮(尿素、各種氨基酸等)。非豆科植物主要是通過(guò)吸收土壤中的硝酸鹽并將其還原為氨這一過(guò)程來(lái)吸收氮元素的，植物的光呼吸過(guò)程中在線粒體釋放出氨，釋放出的氨經(jīng)細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸?shù)饺~綠體，在葉綠體中經(jīng)GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)再同化。GS是高等植物氮素循環(huán)過(guò)程中的關(guān)鍵酶(Miflin?and?Lea，1980，Ammoniaassimilation.In?BJ?Miflin，ed，The?Biochemistry?of?Plants，Vol?5.AcademicPress，New?York，pp?169-202)，有ATP存在的條件下，GS能夠催化Glu結(jié)合無(wú)機(jī)態(tài)的NH₃生成有機(jī)態(tài)的Gln(Ireland?RJ等，1999，In?BK?Singh，ed，Plant?AminoAcids，Biochemistry?and?Biotechnology.Marcel?Dekker，New?York，pp?49-109)。由于光呼吸時(shí)，隨著氨的積累，葉片中谷氨酸和絲氨酸濃度隨之增加，因此，這個(gè)反應(yīng)成為光呼吸過(guò)程中氨再同化過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵反應(yīng)。

研究表明，高等植物中存在兩種不同的同工酶：細(xì)胞質(zhì)型的GS1和葉綠體型的GS2(Hirel?B等，1980，Plant?Physiol.66：619-623)。在葉綠體中表達(dá)的谷胺酰胺合成酶(GS2)在光呼吸氨的再同化作用中起到非常重要的作用(Wallsgrove?etal.，1987，Plant?Physiol?83：155-158；Migge?and?Becker，2000，Plant?Sci153：107-112；Orea?et?al.，2002，Physiol?Plant?115：352-361)，因?yàn)樵诠夂粑^(guò)程中釋放的氨的水平可能超過(guò)初級(jí)氮同化量的十倍，不能合成GS2的突變體植物由于不能同化光呼吸釋放的氨，在空氣中生長(zhǎng)時(shí)會(huì)因氨的過(guò)量積累而死亡，由此可見(jiàn)GS2對(duì)植物生長(zhǎng)的重要性。

Kozaki和Takeba利用35s啟動(dòng)子在煙草中過(guò)量表達(dá)水稻的葉綠體型GS2，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物中光呼吸作用增強(qiáng)，而光氧化作用得到抑制(Kozaki?and?Takeba，1996，Nature?384：557-560)。另外，Andrea等通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有大豆1，5—二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亞基基因(rbcS)啟動(dòng)子及煙草GS2cDNA的雙元載體轉(zhuǎn)入煙草后發(fā)現(xiàn)，得到的兩個(gè)轉(zhuǎn)基因煙草株系中GS2的轉(zhuǎn)錄水平分別是野生型的15和18倍，植物體鮮重分別是野生型的1.2和1.3倍，這說(shuō)明GS2的過(guò)量表達(dá)明顯促進(jìn)了植物生長(zhǎng)(Andrea等，2000，Planta，210：252-260)。