[發明專利]擬南芥細胞質型谷氨酰胺合成酶基因的植物表達載體的構建和應用

無效

• 申請號: 200810233622.3
• 申請日: 2008-11-24
• 公開（公告）號: CN101407824A
• 公開（公告）日: 2009-04-15
• 發明（設計）人: 李昆志;王莎莎;陳麗梅;趙艷;傅冰;王藝霖;潘麗峰
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/52;A01H1/00;A01H4/00
• 代理公司: 昆明今威專利代理有限公司
• 代理人: 賽曉剛

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種擬南芥細胞質型谷氨酰胺合成酶基因GS1的植物表達載體pH2-35S-PrbcS-GS1，其構建方法和應用。

背景技術

氮是植物生長的主要的限制性營養元素，由于耕作土壤中的氮素通常很難滿足作物對氮元素的需求，因此人們常通過對土壤施用大量的氮肥來滿足作物生長的需要。氮肥通常是在高溫高壓條件下生產的，需要消耗大量的能源，而施用的化學肥料氮只有30％左右被農作物吸收利用，其余大部分進入地下水，造成氮素的損失，同時導致水體和環境污染，長期施用化肥還造成土壤板結等，嚴重影響到農業的可持續生產。Clark等(Clark?RB，Duncan?RR.1991.Improvement?of?plant?mineralnutrition?through?breeding.Field?Crop?Res.27：219-24)指出：人類在通過施用化肥改變土壤環境滿足植物需要方面取得了巨大成績，但這種途徑并不是最實用和經濟的辦法，可以運用遺傳學方法提高植物對土壤環境逆境的適應性。因此通過植物基因工程的方法，提高植物本身的氮素同化能力，是一種最自然、最科學、最環保的方式。

植物通常通過兩種途徑獲取所需氮元素：從土壤中吸收硝酸鹽并將其還原為氨，豆科植物也可通過生物固氮的方式從大氣中吸收氮氣并將其還原為氨。由硝酸鹽和氮氣還原產生的氨經GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)循環被植物同化。GS在有ATP供能的前提下催化Glu結合NH₃生成Gln，GOGAT將Gln的氨基基團轉移給α-酮戊二酸從而生成兩分子的Glu(Ireland?RJ，Lea?PJ.1999.The?enzymesof?glutamine，glutamate，asparagine，and?aspartate?metabolism.In?BK?Singh，ed，Plant?Amino?Acids，Biochemistry?and?Biotechnology.Marcel?Dekker，NewYork，pp?49-109)。

植物的GS是由八個亞基構成的聚體，其分子量在320-380kD之間(Stewart?GR，Mann?AF，Fentem?PA.1980.Enzymes?of?glutamate?formation：glutamatedehydrogenase，glutamine?synthetase?and?glutamate?synthase.In?BJ?Miflin，ed，The?Biochemistry?of?Plants，Vol.5，Academic?Press，New?York，pp?271-327)。進一步的生化研究表明在植物中存在不同的GS的同工酶，分別定位在葉綠體(GS2)和細胞質(GS1)中(Hirel?B，Gadal?P.1980.Glutamine?synthetase?in?rice.PlantPhysiol.66：619-623)。在迄今研究到的高等植物中，GS2由單一的核基因編碼并且是葉片中起主要作用的GS同工酶，而GS1則是由一個基因家族的多個同源基因編碼的，并且多種植物的GS1基因已經被成功地克隆出來(Tischer?et?al.，1986；Gebhardt?et?al.，1986；Tingey?et?al.，1987，1988；Bennett?et?al.，1989；Boron?and?Legocki，1993；Roche?et?al.，1993；Marsolier?et?al.，1995；Temple?et?al.，1995)。GS1在植物葉片中的表達量較低，而在韌皮部則具有較高水平的表達。這些GS同工酶的組織特異性和亞細胞水平的特異性表達說明它們的功能是不相重疊的(Tingey?SV，Tsai?F-Y，Edwards?JW，Walker?EL，Coruzzi?GM.1988.Chloroplast?and?cytosolic?glutamine?synthetase?are?encoded?by?homologousnuclear?genes?which?are?differentially?expressed?in?vivo.J?Biol?Chem.263：9651-9657；Oliveira?IC，Coruzzi?G.1999.Carbon?and?amino?acids?reciprocallymodulate?the?expression?of?glutamine?synthetase?in?Arabidopsis?thaliana.Plant?Physiol.121：301-309)。在植物的光呼吸過程中，氨在線粒體中被釋放，釋放的總量可能超過同期初級氮同化作用所吸收的氨的十倍，釋放的氨進入葉綠體中由GS2進行再同化。由于光呼吸釋放出的氨有一個從線粒體出來通過細胞質再進入葉綠體的過程，在這個過程中，會有一部分氨滯留在細胞質中，因此通過基因工程的方法在過量表達細胞質型GS基因有可能提高轉基因植物的氨的再同化效率。Hirel等人(1992，1997)將來自大豆GS1基因與CaMV?35S啟動子融合起來并轉入煙草中，觀察到轉基因植株葉片的葉肉細胞中自身的GS1基因的表達受到相應的誘導，但是在正常的生長條件下轉基因植株的生長狀況以及葉片中GS1活性與對照植株相比沒有明顯變化。Fernando?Gallardo等人(1999)在白楊中過量表達了來自松樹的胞質型GS并使其表達受到CaMV?35S啟動子的調控，這是通過過量表達胞質型GS基因提高樹木的氮素利用率的首次嘗試。Vincent等人(1997)在百脈根中以CaMV?35S啟動子調控來自大豆的胞質型GS的過量表達，發現胞質型GS的上調表達會促進植物的生長和發育，導致植物較早的開花并促進植物的衰老。Fuentes等(2001)在煙草過量表達了來自紫花苜蓿的GS1基因，同樣以CaMV?35S啟動子調控其表達，發現轉基因株系葉片的GS活性比對照植株高6倍，光合能力得到明顯增強，并且在低氮條件下顯示出優于對照植株的生長能力，表現在其莖的伸長、根的干重以及葉片面積均遠遠超出對照植株。近年來也有學者試圖通過過量表達多個GS基因以提高氮素同化能力。例如，Sun等人(2005)利用RT-PCR技術克隆出大豆的GS1和GS2的cDNA并將兩個基因共同連入p2GS雙元植物表達載體并轉入水稻中，使得GS1基因和GS2基因的表達分別受到Act1啟動子和Ubi啟動子的調控，結果說明轉基因植株對低氮條件的耐受力明顯優于對照植株。這些實驗數據提供了大量證據表明GS的過量表達將影響植物的光合速率，提高植物對低氮脅迫的耐受力，也證明了通過基因工程技術提高植物的氮素利用率的方法是可行的。但至今尚未有含有擬南芥基因組中存在的細胞質型的GS1基因的植物表達載體的相關報道。