[發明專利]家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因及用途

無效

• 申請號: 200810233310.2
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101492683A
• 公開（公告）日: 2009-07-29
• 發明（設計）人: 周澤揚;潘國慶;許金山;向仲懷
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: C12N15/30
• 分類號: C12N15/30;C07K14/44;A01N63/02;A01P7/04
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司
• 代理人: 周韶紅

技術領域

本發現涉及生物技術領域，特別是涉及一種來自于家蠶微孢子蟲的繁殖和侵染有關的重要蛋白PTP3基因。

背景技術

微孢子蟲是普遍分布于自然界的細胞內專性寄生原蟲，近150個屬1200余種，有著極為廣泛的宿主，包括脊椎動物和無脊椎動物，是經濟昆蟲、魚類、兔類、產毛動物、嚙齒類及靈長類的致命病原。而家蠶微孢子蟲(Nosema?bombycis)，分類地位屬于原生動物門，單絲孢子蟲亞門，微孢子蟲綱。由微孢子蟲寄生于經濟昆蟲家蠶而引起嚴重的傳染性微粒子病，且由于微孢子原蟲可以通過胚胎向下代傳播，一直被養蠶國家和地區列為蠶業生產法定檢疫對象。單就我國每年因帶毒種和微粒子病而帶來的直接經濟損失即達上千萬元以上。攻克微粒子病這一蠶絲業的頑癥，是蠶業界的重點和難點研究領域。

微粒子病是由微孢子蟲寄生宿主而引起的疾病。微孢子蟲以其獨特的侵染方式，廣泛寄生并感染極具經濟價值的昆蟲、魚類、嚙齒類、兔類、皮毛動物、靈長類以及家庭寵物如狗和鳥，引發嚴重疾病甚至死亡，嚴重制約著世界蠶業生產和動物保育。甚至還能機會性地感染艾滋病(HIV)患者、器官移植病人、服用免疫抑制劑藥物病人和先天性免疫機能不健全者，引起呼吸系統、泌尿系統和皮膚潰爛等惡性疾病，加劇病情，加速病人的死亡。100多年來，盡管已使用了多種化學藥物進行治療，如：咪唑類、煙曲霉素、歌咪啶堿、苯萊特、甲基托布津等等，但治療效果并不理想，至今仍未發現有治療微孢子蟲病的特效藥物。

極管是家蠶微孢子蟲繁殖和侵染的重要器官，在家蠶微孢子蟲對家蠶的侵染中起著關鍵性作用。極管長度一般在50～150μm，直徑一般在0.1～0.2μm范圍。極管具有柔韌性，在運送孢原質的過程中其管直徑可以增加到0.4μm，孢原質運送完畢后其長度會縮短5～10％。在家蠶微孢子蟲入侵過程中，極管在適當刺激后迅速彈出并“刺入”家蠶細胞中，同時將孢原質注入其細胞質，完成對家蠶的入侵。而其組成成分主要是蛋白，而極管蛋白PTP1是它主要的組成部分。極管蛋白PTP1是一種伴刀豆球蛋白，是極管的主要蛋白，在E.hellom中PTP1蛋白的含量占整個極管蛋白的70％。通過SDA-PAGE和銀染分析PTP1發現，不同種類的微孢子蟲的PTP1分子大小不等。對不同微孢子蟲PTP1蛋白的研究表明，PTP1蛋白具有疏水性、高脯氨酸含量和免疫抗原性等諸如特征(Delbac?et?al.，1998)。而PTP2和PTP3也是構成極管的重要組分。有研究認為，在極管彈出過程中，PTP1和PTP2在孢子激活之前呈類結晶狀蛋白質單體，發芽過程中在極管頂端形成聚合體，而PTP3通過調控PTP1-PTP2聚合體的構象狀態影響極管的彈出。另外，極管蛋白PTP1的糖基化作用對極管的構造起著重要的作用，從而間接影響微孢子蟲對宿主細胞的入侵。但是目前關于微孢子蟲極管蛋白的研究僅局限于Encephalitozoon、Glugea、Ameson和Nosema等部分微孢子蟲屬的少量微孢子蟲。

發明內容

本發明擬基于基因組分析數據，其目的在于提供一種家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基因。通過分析PTP3的功能、組成和特性，弄清極管蛋白PTP3在家蠶微孢子蟲極管彈出過程中的作用，探明家蠶微孢子蟲侵染宿主家蠶致病的機制，對生產實踐和疾病防治具有極其重要的意義。

本發明申請人通過對家蠶微孢子蟲極絲蛋白PTP3基因的克隆，得到了該蛋白基因的編碼序列，具體方法如下：

(1)同源性預測：通過對家蠶微孢子蟲與兔腦炎微孢子蟲基因組的基因同源性分析，得到了家蠶微孢子蟲極管蛋白PTP3基因序列CDS；

(2)引物設計：利用引物設計軟件Primer?5.0進行引物設計，在正向引物加入BamHI酶切位點，在反向引物加入Sal?I酶切位點，引物序列分別為：

PTP3-Primer-F5’-CGGGATCCCTACACATTATTTG-3’

PTP3-Primer-R5’-CGGTCGACGTGATGATGGGATTCC-3’

(3)極絲蛋白PTP3?PCR擴增和克隆：利用提取的微孢子基因組直接作為模板，采用基因組PCR擴增目的片段；將擴增片段克隆到pMD18-T(TaKaRa)載體上，然后進行序列測定(上海英俊)，從而獲得的極絲蛋白PTP3全長編碼序列；