[發(fā)明專利]融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810232711.6
• 申請日: 2008-12-11
• 公開（公告）號: CN101544697A
• 公開（公告）日: 2009-09-30
• 發(fā)明（設計）人: 張英起;朱文華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C07K1/22;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 張震國

技術領域

本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術領域，具體涉及融合蛋白重組質(zhì)粒的構建、在原核細胞中的表達、目的蛋白的純化，特別涉及一種能夠誘導出抗B7-H4抗血清的融合蛋白TT-B7-H4IgV及其制備方法和用途。

背景技術

1、B7-H4分子及其研究

B7-H4(B7-S1，B7x)是在2003年時，由Chen等三個實驗室利用生物信息學的方法相繼發(fā)現(xiàn)的B7家族新成員。他們是以現(xiàn)有的B7家族成員的胞外段可變區(qū)(IgV+IgC)為查詢序列，對GenBank中的EST序列(表達序列標簽)進行搜索時發(fā)現(xiàn)的，并在人胎盤cDNA文庫中得到了全長序列。B7-H4不能與CD28、CTLA-4和ICOS結合，它與未知受體結合，調(diào)節(jié)免疫反應。近年來，越來越多的資料表明，B7-H4可能與腫瘤免疫逃逸、自身免疫性疾病等的發(fā)病機理與治療息息相關。

1.1?B7-H4的結構與分布特點

1.1.1?B7-H4的結構

經(jīng)查找美國NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，B7-H4蛋白由信號肽區(qū)、一對VC免疫球蛋白胞外段、跨膜區(qū)和胞漿區(qū)組成，共282個氨基酸，屬I型跨膜糖蛋白，通過GPI鉚定于細胞膜，其中IgV區(qū)為54-130位氨基酸。B7-H4分子最顯著的特征是胞漿區(qū)僅含有兩個氨基酸殘基。在空間結構上，該分子在配體-受體結構域上與B7家族的同源性分別為：B7-1?13％，B7-2?13％，B7h?14％，B7-H1?20％，B7-DC16％及B7-H3?24％。hB7-H4分子的IgV區(qū)和mH7-H4的IgV區(qū)同源性高達91％，然而該區(qū)同CD80和CD86的同源性僅為23％。B7-H4的氨基酸序列如下：MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSDIVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTDAGTYKCYIITSKGKGNANLEYKTGAFSMPEVNVDYNASSETLRCEAPRWFPQPTVVWASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK。

1.1.2?B7-H4的分布

RT-PCR實驗結果顯示正常組織中發(fā)現(xiàn)有B7-H4mRNA表達，如胎盤、肝臟、肺、脾、骨骼肌、腎、小腸等等。然而，免疫組化的結果顯示，正常組織中不表達B7-H4，僅在某些腫瘤組織中能檢測到表達，如卵巢癌、乳腺癌、肺癌；與B7-H1表達情況不同，在黑色素瘤細胞表面檢測不到B7-H4的表達。通過細胞流式術檢測，發(fā)現(xiàn)在活化后的人T細胞、B細胞、巨噬細胞、DC細胞上B7-H4呈誘導性表達。此外，小鼠脾B220⁺B細胞組成性表達B7-H4，而活化后則下調(diào)表達。對小鼠組織的Northern?blot實驗發(fā)現(xiàn)，根據(jù)組織類型的不同，小鼠的B7-H4共有4種不同的mRNA剪切形式。肝組織具有這四種剪切形式的高水平表達，它們的大小分別為7.5，4，2.6和1.8kb。靈敏的RT-PCR分析顯示，人類組織至少擁有兩個轉錄本。同時還有研究表明，正常外周組織能在轉錄水平上對B7-H4的表達進行嚴密的調(diào)控。

1.2?B7-H4的受體研究

B7-H4-Ig融合蛋白標記和流式細胞分析(FCM)發(fā)現(xiàn)，B7-H4-Ig融合蛋白可以結合佛波脂和離子毒素或抗CD3/CD28抗體活化的T細胞，這提示在活化T細胞上存在B7-H4的可能受體。將B7-H4-Ig融合蛋白分別和高表達CD28，ICOS，PD-1和CTLA-4的轉基因細胞相互作用，實驗結果表明，B7-H4-Ig融合蛋白不能與上述各轉基因細胞結合。另外，CTLA-Ig能與轉B7-2基因的CHO細胞結合，但卻不能與轉B7-H4基因的細胞結合。這些均表明表達在活化T細胞上的B7-H4受體不同于CD28，ICOS，PD-1和CTLA-4。