[發明專利]一種B19病毒VP1獨特區基因

有效

• 申請號: 200810232479.6
• 申請日: 2008-11-28
• 公開（公告）號: CN101475942A
• 公開（公告）日: 2009-07-08
• 發明（設計）人: 張國成;李志宏;聶曉晶;許東亮
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第四軍醫大學
• 主分類號: C12N15/35
• 分類號: C12N15/35;C12N15/70;C07K14/015;C07K16/08;A61K39/42;A61P31/20
• 代理公司: 西安通大專利代理有限責任公司
• 代理人: 陸萬壽

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及B19病毒基因的克隆，特別涉及一種B19病毒VP1獨特區的新基因片段的克隆，并構建原核表達載體、表達純化獲得有免疫原性的重組蛋白VP1獨特區。?

背景技術

1.B19病毒及其致病性?

人細小病毒B19(Human?Parvovirus?B19，PVB19)是1975年Cossart?YE用對流免疫電泳法篩選健康獻血者血液中乙型肝炎病毒時于第19號標本中偶然發現的，因此得名。它是細小病毒科細小病毒屬中目前己知的唯一致人類疾病的病毒，也是動物病毒中體積最小結構最簡單的DNA病毒。1981年，在患鐮狀細胞貧血和再生障礙性貧血的兒童中檢測到這種病毒，從而證實了其致病性，以后又相繼在傳染性紅斑(又稱第五病)、血小板減少性紫癜、關節病、心肌炎、心包炎、急性肝炎患者中檢測到該病毒，而且還發現該病毒能通過胎盤感染胎兒，引起孕婦流產、早產或胎兒水腫、死胎。1987年在1例先天性免疫缺陷綜合征貧血病人中證實存在有慢性B19病毒感染。隨后的研究顯示在AIDS患者、器官移植的受者、化療的腫瘤病人等免疫抑制患者中都有慢性持續性B19病毒感染的存在。近年來，還證實B19病毒感染與川崎病、一過性成紅細胞減少、系統性紅斑狼瘡、皮肌炎、慢性自身免疫性血小板/中性粒細胞減少癥、某些嚴重的肝炎、由免疫復合物介導的腎臟損害及睪丸生殖細胞瘤等疾病有關，甚至可引起敗血癥。?

張國成等于1990年首次從育齡婦女及兒童中檢測出B19病毒特異性抗體，證實我國存在B19病毒感染。隨后在國內率先展開了對B19病毒與疾病?的關系、B19病毒感染的診斷、治療及預防等方面的研究，陸續發現并報道了B19病毒是我國孕婦非免疫性流產、兒童急性再障危象、急性血小板減少性紫癱等疾病的重要病因之一。張國成等對自然流產的胚胎組織和先天性心臟患兒的心肌組織標本進行B19病毒DNA和IgM檢測，提示B19病毒宮內感染可能與自然流產和先天性心臟病的發生有一定關系；并通過PCR，RT-PCR及ISH等分子生物學技術檢測先心病心肌組織中的B19病毒基因，發現有較高的陽性率，其主要分布在心肌細胞核內，提示B19病毒可能是先天性心臟病發病的重要病原，參與了核酸的表達而影響心臟的發育，導致了心臟畸形。?

B19病毒的傳播途徑主要通過呼吸道、血液制品和母嬰垂直傳播，高效價的病毒血癥使經血液或血制品傳播的可能性增加。在自愿獻血員中，B19病毒的檢出率為1:167至1:35000，主要分布于17-45歲，以1-39歲最為明顯。在中國，獻血員中B19病毒的檢出率為5.08％。?

2.B19病毒的結構特征及分型?

B19病毒顆粒由兩個衣殼蛋白和一條線狀的單鏈DNA分子組成，呈對稱的二十面立體結構，無包膜，直徑22-24nm，平均23nm。在電鏡和陰性染色中可見空殼和完整的病毒顆粒，成熟的有感染力的病毒顆粒分子量為5.6×10⁶道爾頓，其中DNA占全重的一半。B19病毒基因為單鏈小DNA，全長5596bp，兩端有383bp長的重復序列形成復式發卡結構，G、C含量高，具有強同源性，是合成整條鏈的引物。兩端的復式發卡結構使得B19病毒基因二級結構牢固，而不易克隆入細菌中。在B19病毒基因組內有兩個大的開放讀框，幾乎延伸整個基因組，左側的開放讀框(406-2501bp)編碼非結構蛋白(NS)，右側的開放讀框編碼兩個衣殼蛋白VP1和VP2。VP2的氨基酸編碼序列(3088-5093bp)包含在VP1的氨基酸編碼序列(2416-5093bp)中，其組成比后者少226個氨基酸的氨基尾，故這兩種衣殼蛋白在氨基酸組成上具有同一性。VP1蛋白中不包含VP2蛋白的區域稱為VP1獨特區蛋白區。VP1和VP2組成衣殼包裹在B19?病毒DNA表面，構成B19病毒的抗原性，其中95％由VP2組成，VP1僅占5％。病毒的主要中和抗原表位位于VP1獨特區和VP1-VP2連接區。雖然VP1的量比VP2少，但是VP1獨特區對于形成成熟的B19病毒殼粒至關重要，VP1的大部分片段延伸到衣殼外部，是刺激機體產生中和性抗體的主要抗原，更容易與抗體結合。?