[發(fā)明專利]HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810232319.1
• 申請(qǐng)日: 2008-10-30
• 公開（公告）號(hào): CN101503738A
• 公開（公告）日: 2009-08-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李安敏;王云普;廖世奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西北師范大學(xué);蘭州普利生物技術(shù)開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;G01N33/577;G01N21/00
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司
• 代理人: 李艷華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測(cè)試劑盒，尤其涉及一種HIV病毒抗原及配體管式PCR檢測(cè)試劑盒及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

早期蛋白質(zhì)檢測(cè)是以抗體同特定待檢物蛋白質(zhì)的低解離常數(shù)和一定的特異性為基礎(chǔ)，采用簡(jiǎn)易方便的篩選方法——抗體捕捉法。該法是檢測(cè)樣品中有無抗原：首先將抗原包被于固相支持物，然后用抗體去結(jié)合抗原形成復(fù)合物，沖洗去掉未結(jié)合的抗體，最后用和結(jié)合抗體特異識(shí)別的標(biāo)記分子去檢測(cè)結(jié)合抗體；也可以抗原、抗體先反應(yīng)形成復(fù)合物后，再結(jié)合到固相支持物上，然后檢測(cè)復(fù)合物。許多抗體捕捉法是利用間接法來檢測(cè)抗體，如檢測(cè)抗體是鼠抗體，則檢測(cè)分子可能是帶檢測(cè)標(biāo)記的兔抗鼠抗體，所用的傳統(tǒng)檢測(cè)標(biāo)記包括放射性同位素、染料和作用于底物產(chǎn)生可檢測(cè)分子如色原的酶。

酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)是廣為人知的免疫檢測(cè)法，傳統(tǒng)的ELISA技術(shù)似三明治夾心法，即兩抗體共同結(jié)合到某一抗原——捕捉抗體，將其同樣品中的抗原結(jié)合，再加入同抗原結(jié)合的偶連酶的檢測(cè)抗體，然后反應(yīng)形成捕捉抗體—抗原—檢測(cè)抗體“三明治”復(fù)合物，最后測(cè)偶連酶活性顯示檢測(cè)結(jié)果。雖然抗體檢測(cè)法具有較大的應(yīng)用價(jià)值，但是它的檢測(cè)范圍受捕捉抗體和抗原反應(yīng)的解離常數(shù)(Kd)值限制。在實(shí)踐中，檢測(cè)低限大約是Kd值的1％，當(dāng)待分析物濃度降低到這個(gè)可能檢測(cè)極限時(shí)，所捕捉到的待分析物抗體百分率將不足以產(chǎn)生相對(duì)于信噪比的可檢測(cè)信號(hào)。因此，用熒光或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系的抗體檢測(cè)法的檢測(cè)下限約1pg/ml(10-4M對(duì)平均分子量50,000道爾頓的蛋白質(zhì))。

隨著基因技術(shù)應(yīng)用的快速發(fā)展，在抗原抗體檢測(cè)方面已有較多的基因檢測(cè)技術(shù)。

核酸待測(cè)物的檢測(cè)要求不同于抗體檢測(cè)的技術(shù)。在二十世紀(jì)八十年代中期，DNA技術(shù)的研究發(fā)現(xiàn)了通過酶重復(fù)擴(kuò)增過程可擴(kuò)增DNA的方法，后來叫聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)：首先加入兩互補(bǔ)的寡核苷酸序列(叫引物)，它將結(jié)合在所要擴(kuò)增的區(qū)域的兩側(cè)，然后加熱變性，在降溫退火過程中讓引物同互補(bǔ)序列結(jié)合，再加入Klenow片段DNA聚合酶I以延伸引物，通過重復(fù)變性、退火、延伸所希望的片段，目標(biāo)DNA就會(huì)以指數(shù)方式擴(kuò)增。PCR曾經(jīng)過許多改進(jìn)，一個(gè)重要的變化是耐熱聚合酶(即Taq聚合酶)的應(yīng)用，它產(chǎn)于溫泉中嗜熱菌，具有熱穩(wěn)定性，幾乎不被PCR變性中高溫影響，所以不必像應(yīng)用不耐熱的Klenow聚合酶I，每一次變性后得補(bǔ)加聚合酶。

在以PCR作為擴(kuò)增系統(tǒng)的運(yùn)用中，產(chǎn)生了免疫-PCR方法。該法是把特定待測(cè)物連接到微孔板上，然后用PCR擴(kuò)增放大能力來檢測(cè)——例如小牛血清白蛋白(BSA)被動(dòng)吸附到一免疫檢測(cè)板上，加入對(duì)BSA的特異抗體(連有蛋白A鏈親和素融合蛋白及生物素標(biāo)記的報(bào)告擴(kuò)增子)，PCR后用瓊脂糖電泳分析報(bào)告擴(kuò)增子，可檢測(cè)到幾百個(gè)BSA分子，但這種方法不能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，同時(shí)因?yàn)槿狈Υ郎y(cè)物的特異捕捉分子，也不能用于生物樣品檢測(cè)。為此，人們不斷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)：首先用生物素化第二抗體和一個(gè)連接生物素化報(bào)告擴(kuò)增子的鏈親和素融合蛋白，然而5種試劑的加入、洗板、擴(kuò)增、檢測(cè)很費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且解離復(fù)雜；隨后又把報(bào)告擴(kuò)增子共價(jià)連到第二抗體上，雖然直接連接減少了試劑數(shù)目和解離復(fù)雜性，但仍需要PCR操作，勞動(dòng)強(qiáng)度和試驗(yàn)室污染的可能性還是無法降低。

三明治式免疫-PCR是由傳統(tǒng)ELISA方式的改編而來，即檢測(cè)抗體連有DNA標(biāo)記，再運(yùn)用到分析檢測(cè)生物樣品。早期的抗體免疫-PCR檢測(cè)形式是將初級(jí)抗體固定在平板上，然后依次加入樣品，再用生物素化檢測(cè)抗體，鏈親和素和生物素化的DNA；后來改進(jìn)為直接連接DNA到抗體上和用標(biāo)記引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物，而PCR的擴(kuò)增能力可產(chǎn)生大量DNA標(biāo)記，這種DNA標(biāo)記可用典型的凝膠電泳檢測(cè)分析。PCR擴(kuò)增抗體攜帶的DNA標(biāo)記可提高對(duì)抗原檢測(cè)的靈敏度(該法缺少用基因芯片法來檢測(cè))，比傳統(tǒng)ELISA方法的靈敏度還高，但用凝膠電泳純化擴(kuò)增產(chǎn)物需要大量人工操作，因此耗時(shí)；而且用于PCR擴(kuò)增的引物在退火時(shí)可引起二聚體擴(kuò)增產(chǎn)生副產(chǎn)品；同時(shí)它還存在污染核糖或污染也將同樣被擴(kuò)增的情況。

免疫PCR方法是采用一個(gè)捕捉抗體，類似于直接ELISA三明治夾心法，不同點(diǎn)在于選擇檢測(cè)方法。該方法已被成功用于檢測(cè)腫瘤壞死因子、β-半乳糖甘酶、人甲狀腺刺激激素、鼠可溶T-細(xì)胞受體、重組乙肝表面抗原、不同的人心鈉素、β-葡糖苷激酶、絨毛膜促性腺激素等物質(zhì)，有的敏感度達(dá)10^-15摩爾水平。