[發(fā)明專利]煤礦酸性礦井水底泥DNA提取方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810231369.8
• 申請日: 2008-12-15
• 公開（公告）號: CN101648985A
• 公開（公告）日: 2010-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張建云;崔樹軍;谷立坤;趙保生;廉有軒;金維平;吳燁;武秀琴;張慶甫;劉道偉
• 申請（專利權(quán)）人: 河南工程學(xué)院
• 主分類號: C07H21/04
• 分類號: C07H21/04;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及DNA的提取與純化，具體涉及煤礦酸性礦井水底泥DNA提取方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

煤礦在開采過程中，因含煤地層中所含硫化物(主要為黃鐵礦)的賦存環(huán)境變化而自發(fā)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，可導(dǎo)致產(chǎn)生酸性礦排水。酸性礦排水具有低pH值和較高的礦化度特征，有很強(qiáng)的溶解性和侵蝕性，這種礦排廢水能攜帶大量的重金屬及有害化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入環(huán)境。煤礦酸性廢水中的一些有害物質(zhì)還會在河流底泥中沉積，底泥中各種污染物長時間釋放同樣又會影響下游水體的水質(zhì)。目前對煤礦酸性廢水影響河流水質(zhì)方面進(jìn)行了較多的研究。

微生物對煤礦酸性廢水中的一些有害物質(zhì)可以產(chǎn)生吸附、轉(zhuǎn)化、降解、富集等作用，目前微生物分子生態(tài)學(xué)微生物分子生態(tài)學(xué)作為分子生物學(xué)與微生物生態(tài)學(xué)交叉而形成的學(xué)科，在環(huán)境科學(xué)方面廣泛應(yīng)用。分子生態(tài)學(xué)實驗技術(shù)可以了解微生態(tài)系統(tǒng)中微生物群體結(jié)構(gòu)、多樣性及其功能相關(guān)性，了解體系中微生物具有的重要作用，從而進(jìn)一步利用生物強(qiáng)化手段，處理還擊污染問題。目前，煤礦酸性廢水底泥的微生態(tài)研究很少，主要原因是國外DNA提取試劑盒價格昂貴，采用自配試劑又難以脫除底泥中的PCR(DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))抑制因子(如腐殖酸等)，且不能對微生物宏基因組DNA完整提取，不能完整了解煤礦酸性廢水底泥微生物的群落結(jié)構(gòu)。目前有關(guān)DNA提取的專利有公開號：CN1401782，CN1420124，CN1198439，CN101148664，CN101173274，CN101230342等。國外DNA提取相關(guān)專利有：IPC：C12Q1/68；C12Q1/68；IPC：C12M1/18；C12Q1/68；C12M1/16；(+1)，IPC：A61K39/04；C12N1/21；C12P21/00；(+5)等。

本專利是提供一種采用助劑洗脫微生物，膜過濾，細(xì)菌裂解的微生物DNA提取方法，本方法未見報道。利用本專利，可以加深對煤礦酸性廢水底泥的微生態(tài)了解，有助于對煤礦酸性廢水中一些有害物質(zhì)進(jìn)行原位生物處理。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是應(yīng)用生物化學(xué)，分子生物學(xué)技術(shù)，提供一種能夠高效提取純化煤礦酸性礦井水底泥DNA的方法，以解決常規(guī)DNA提取試劑盒對煤礦酸性礦井水底泥DNA提取效率不高，必須進(jìn)行DNA后續(xù)純化工作并且提取產(chǎn)物腐殖酸類物質(zhì)較多，影響后續(xù)的PCR等分子生物學(xué)操作的問題，以便更好的應(yīng)用于煤礦酸性礦井水底泥多樣性的分子生態(tài)學(xué)研究。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)上述發(fā)明目的的。

本發(fā)明為煤礦酸性礦井水底泥DNA的提取與純化方法，具體方法為：

1.煤礦酸性礦井水底泥微生物樣品的收集

收集煤礦酸性礦井水底泥樣品加入洗脫液，加入含有吐溫(吐溫80或40)pH5.0-7.0的磷酸緩沖洗脫液，37℃恒溫振蕩30分鐘，超聲波振蕩5分鐘，低轉(zhuǎn)速離心，大量菌體留于上清中。

2.膜過濾收集菌體：0.5μm膜過濾上清，菌體停留于膜上。

3.DNA的提取

帶膜菌體加入裂解緩沖液(100-200mM?Tris-HCl[pH8.0]，50-100mM?EDTA[pH8.0]，50-100mM?sodium?phosphate[pH8.0]，1.0-1.8M?NaCl)，同時加入蝸牛酶，溶菌酶，使其終濃度均在10ng/ml-100ng/ml。37℃恒溫振蕩20-60分鐘，再加入蛋白酶K，使其終濃度均在10ng/ml-100ng/ml，37℃恒溫振蕩20-60分鐘，取出加入SDS溶液，使SDS終濃度為0.4-1.2％，60℃恒溫30-60分鐘，每十分鐘劇烈震蕩30秒。加入等體積氯仿∶異戊醇(V/V?24∶1)于提取液中，6000-8000g離心5-20分鐘，吸取上清。加入三分之二體積異丙醇室溫15-30℃靜置2-6小時，10000-12000g離心10-20分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌兩次，無菌環(huán)境下干燥。

具體實施方式

1.煤礦酸性礦井水底泥樣品中微生物的收集

選定煤礦酸性礦井水底泥位點(diǎn)，五點(diǎn)取樣法取煤礦酸性礦井水底泥，加入100ml含有吐溫(吐溫80或40)pH5.0-7.0的磷酸緩沖洗脫液，37℃恒溫振蕩器振蕩30分鐘，超聲波振蕩6分鐘，每隔兩分鐘拿出劇烈搖勻，收集超聲波振蕩后的懸濁液，1000g離心10分鐘，收集上清。

2.膜過濾菌體：

0.5μm膜減壓抽濾，收集膜。

3.破裂細(xì)胞