[發明專利]納濾濃縮純化核酸酶P1及生產核苷酸的方法

無效

• 申請號: 200810228656.3
• 申請日: 2008-11-10
• 公開（公告）號: CN101392240A
• 公開（公告）日: 2009-03-25
• 發明（設計）人: 喬賓福;俞慧君;霍旭輝
• 申請（專利權）人: 大連珍奧生物技術股份有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12P19/34;C12R1/80
• 代理公司: 大連非凡專利事務所
• 代理人: 閃紅霞

技術領域：

本發明涉及一種核酸酶P₁的純化的方法以及用純化的核酸酶P₁生產核苷酸的方法。尤其是使用現代的分子量級分離技術(納濾)，將具有降解核糖核酸成為5′核苷酸的核酸酶P₁濃縮、純化成為高活性、穩定性的液體酶；使用這種酶液制備了5′核苷酸溶液，并進一步使用分子量級分離技術(超濾和納濾)純化、濃縮5′核苷酸溶液，以生產5′核苷酸成品。

背景技術：

5′核苷酸包含5′腺苷酸、5′鳥苷酸、5′胞苷酸、5′尿苷酸，它們不僅是基因工程中合成生命的遺傳物質核糖核酸(RNA)和寡核苷酸的基本原料，而且是許多抗腫瘤、抗病毒藥物的前體，在動物飼料中添加5′核苷酸具有提高免疫功能、促進生長、代謝的功能，在農業上噴灑、灌溉、浸種使用，具有促進植物生長、開花、結果增多的功效。從上世紀90年代后國外大量報導5′核苷酸是一類功能性輔助食品，具有顯著的免疫功能，國內市場需求擴大，產量明顯提高。

同時生產四種5′核苷酸只能使用專一性的酶(核酸酶P₁)降解核糖核酸的方法。迄今為止，在工業生產上要獲得核酸酶P₁只有兩條途徑：第一是培養一種菌株在細胞外分泌核酸酶P₁；第二是從麥芽中浸提此酶。從麥芽中浸提涉及麥芽資源的來源、保存、抽提體積龐大，工序繁復、酶活力不高，在工業生產中使用不是最佳方案。對于核酸酶P₁的使用，國際上已發展到固定化酶、固相化酶(干粉酶)及液體酶三種方式。以固定化酶及固體酶而言，不僅制備技術要求很高，而且生產成本也很高，以干粉核酸酶P₁為例，進口價每公斤在2500元～3000元人民幣，用于生產5′核苷酸，它將占主要原料成本價的30％左右，不利于5′核苷酸的大規模生產。

目前，用液體核酸酶P₁生產5′核苷酸的方法都是直接用未經純化的液體核酸酶P₁降解核糖核酸得到5′核苷酸溶液，然后再經過離子交換樹脂的分離工藝進一步分離，去除雜質并得到5′腺苷酸、5′鳥苷酸、5′胞苷酸、5′尿苷酸單體。雖然產品純度很高，可達到98％～102％，但是卻存在著成本高、收率低的問題，也不利于5′核苷酸的大規模生產，尤其是對于不需要5′核苷酸單體且不需要高純度5′核苷酸產品的生產，此種方法更不適用。

發明內容：

本發明是針對現有技術所存在的成本高、收率低、不適合大規模生產等問題，提供一種工序簡單、收率高、成本低、質量穩定、適合大規模生產的納濾濃縮純化核酸酶P₁及生產核苷酸的方法。

本發明的技術解決方案是：一種納濾濃縮純化核酸酶P₁的方法，其特征在于按如下步驟進行：

a.選高活性的桔青霉菌株M71，在培養基中經液體深層發酵得到核酸酶P₁；

b.用離心機除去菌體和培養基的固形物，得含核酸酶P₁的上清液；

c.納濾膜透析除去部分水、無機鹽及色素。

所述a步驟是以葡萄糖2％～10％為碳源，蛋白胨0.3％～0.8％為氮源。

所述a步驟的條件是：培養基所含成分及重量百分比是：葡萄糖5％、蛋白胨0.5％、K₂HPO₄?0.05％、KH₂PO₄?0.05％、MgSO₄?0.04％、CaCl₂?0.04％、ZnSO₄0.02％；PH?6.0；培養條件：28℃～30℃，通風攪拌培養，培養25hr。

所述c步驟是經切割分子量為300～10000道爾頓的納濾膜透析。

所述c步驟是加入無離子水反復進行，使酶液濃縮倍數為5～16倍。

一種用前述方法得到的濃縮純化核酸酶P₁生產核苷酸的方法，其特征在于按如下步驟進行：

d.用濃縮純化核酸酶P₁降解核糖核酸，底物核糖核酸質量濃度2％～5％，濃縮核酸酶P₁的用量為總體積1.4％～4％，PH5.5～6.2，溫度65℃～70℃，降解時間3～5小時得降解液；

e.將降解液經過20nm～50nm的陶瓷膜超濾；