[發明專利]一種萃取和常壓柱層析法純化微囊藻毒素MCLR的方法

無效

• 申請號: 200810227951.7
• 申請日: 2008-12-03
• 公開（公告）號: CN101750460A
• 公開（公告）日: 2010-06-23
• 發明（設計）人: 梁文艷;王金麗;陳莉
• 申請（專利權）人: 北京林業大學
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 北京法思騰知識產權代理有限公司 11318
• 代理人: 楊小蓉

技術領域

本發明涉及分析化學領域，具體地，本發明涉及一種萃取和常壓柱層析法純化 微囊藻毒素MCLR的方法。

背景技術

我國地表水體由于日趨嚴重的富營養化而加劇了水華的頻繁發生。水華發生時， 藻類大量繁殖和腐爛，導致水味腥臭，水體透明度降低，并影響水體中的溶解氧， 造成水生生態嚴重惡化。某些藻類(如藍藻)死亡后，由于細胞溶解而釋放的藻毒素， 對人類健康造成很大的影響。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)是一類在藍藻水華污 染中出現頻率高、產生量大和造成危害嚴重的藻毒素，它能夠特異性的與蛋白磷酸 酶PP1和2A的絲氨酸/蘇氨酸亞基結合，從而抑制它們的活性，促進腫瘤的發生。 鑒于MCs對人體健康的潛在危害，目前國內外針對MCs毒性以及控制對策開展了廣 泛的研究。然而高純度MCs樣品的稀有成為制約MCs研究發展的瓶頸，因此需要開 發出簡單有效地提純MCs的方法，以滿足對于MCs純品的需求。微囊藻毒素 LR(Microcystin?LR，MCLR)是MCs中毒性最大的一種毒素，極具代表性。

目前，將MCs粗品經過固相萃取等簡單凈化，再應用不同類型的C18分離柱在 高效液相色譜(HPLC)上根據MCs紫外吸收出峰時間收取對應的流動相是提純MCs 有效的方法，包括制備型和半制備型液相色譜等。這些方法雖然可以獲得較高純度 的MCs，但儀器和分離柱價格昂貴，在一般的實驗室條件下難于實現，而且每次提 純的MCs量也很少，不能滿足批量制備MCs純品的要求。

發明內容

本發明的目的在于提供一種萃取和常壓柱層析法提純MCLR的方法。

根據本發明的方法包括以下步驟：

1)破碎藻細胞：將藻細胞懸液高速離心10～20min，棄去上清液，用超純水清洗 沉淀，再離心，重復2～4次，得到藻細胞殘渣，采用超聲或反復凍融等方法進行細胞 破碎；

2)向破碎的藻細胞中加入甲醇，使甲醇的終濃度為40～100％、優選80％，進行 藻毒素的振蕩提取，收集提取后的上清液，可以1～3次，合并各次的上清液，在30 ℃下蒸發去除甲醇；

3)對步驟2)得到的水溶液進行液液萃取，以去除部分親有機相的雜質，抽取 水相，得到MCLR水溶液，重復該步驟4～8次；

4)對步驟3)得到的MCLR水溶液進行C18固相(用100％甲醇活化)萃取， 用0～20％的甲醇洗脫雜質，最后用50～80％甲醇洗脫MCLR，以去除部分極性與 MCLR相差較大的物質，將得到的MCLR洗脫液蒸發至干，并用100％甲醇溶解， 得到MCLR甲醇溶液；

5)將步驟4)得到的MCLR甲醇溶液上樣至Sephadex?LH-20凝膠層析柱，進 行層析分離，以100％甲醇為流動相，流速為0.5mL/min，收集MCLR活性峰，濃縮 蒸干后溶于超純水中，得到MCLR水溶液；以及

6)將步驟5)得到的MCLR水溶液上樣至DEAE離子交換層析柱(DEAE Sepharose?CL-6B離子交換層析柱)，用超純水進行平衡，再用3mmol/L?NaCl溶液洗 脫，流速為1.5mL/min，收集MCLR活性峰，制得MCLR純品。

根據本發明的方法，在步驟3)中，使用正己烷、二氯甲烷或三氯甲烷、優選正 己烷進行液液萃取，萃取比例為：水相：有機相＝2：1。

根據本發明的方法，在步驟4)中依次使用0％、5％、20％的甲醇洗脫雜質。

本發明提供的萃取和常壓柱層析法提純MCLR的方法，其中使用的液液萃取法 可以有效地實現除色和脫脂。所使用的Sephadex?LH-20凝膠是集吸附和分子篩雙重 作用于一體的填料，并且可用有機溶劑作流動相，能夠去除色度和干擾物。DEAE Sepharose?CL-6B是一種弱陰性離子交換材料，容量大，能分離mg級的MCLR，該 材料對離子強度極敏感，只需用低濃度鹽溶液即可將MCLR洗脫。大量研究發現， 采用萃取和常壓柱層析法提純MCLR，具有良好的重現性。MCLR的回收率可達 60～85％。

與其他MCs提純方法相比，本發明提供的方法優點在于，該法具有簡便有效、 經濟實用、在一般實驗條件下即可實現并且相對穩定的特點，能夠制備毫克級MCLR 純品，經HPLC分析，其純度達85％以上。

附圖說明

圖1為粗提液液相色譜圖。

圖2為液液萃取前后MCLR水樣掃描圖。