[發(fā)明專利]表達抗體或抗體類似物的重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810227780.8
• 申請日: 2008-12-03
• 公開（公告）號: CN101413002A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉波;吳軍;唱韶紅;鞏新;馬清鈞
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所
• 主分類號: C12N15/13
• 分類號: C12N15/13;C12N15/62;C12N1/19;C07K16/00;C07K19/00;C12R1/645
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 關(guān) 暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及表達抗體或抗體類似物的重組克魯維酵母菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

抗體(Antibody，Ab)是一種與抗原特異性結(jié)合的糖蛋白。天然抗體約150?000道爾頓，由兩個相同的輕鏈(Light?Chain，L)和兩個相同的重鏈(Heavy?Chain，H)組成。輕鏈與重鏈通過一個共價二硫鍵相連。每條重鏈由一個可變區(qū)(VH)和多個恒定區(qū)組成。每條輕鏈由一個可變區(qū)(VL)和一個恒定區(qū)組成；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一個恒定區(qū)相對，輕鏈的可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)相對。木瓜蛋白酶消化抗體可產(chǎn)生兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為“Fab”片段，每個片段有單個抗原結(jié)合位點)以及一個殘余的“Fc”片段(可結(jié)晶的片段，其分子量大約為50?000)。用胃蛋白酶處理產(chǎn)生一個F(ab’)₂片段，該片段有兩個抗原結(jié)合位點，并仍能與抗原交聯(lián)(黃志偉，王琰.抗體工程.第二版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2002)。

抗體分子的突出特點是其分子結(jié)構(gòu)的雙重性：識別不同抗原需要結(jié)構(gòu)上的多樣性，與體內(nèi)效應(yīng)系統(tǒng)相互作用需要結(jié)構(gòu)的恒定性。這使抗體分子成為體內(nèi)最復(fù)雜的分子，長期以來一直是人們研究的熱點。抗體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用極為廣泛，其制備技術(shù)經(jīng)歷了從多克隆抗血清、單克隆抗體到基因工程抗體等三個發(fā)展階段。

近5年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體技術(shù)及制備技術(shù)的成熟，基本上克服了鼠源性抗體在人體應(yīng)用時產(chǎn)生抗抗體的問題；同時由于在人鼠嵌合抗體、人源化抗體和人抗體中采用人的Fc片段，在人體內(nèi)的半衰期從鼠源性抗體的小于20小時到人源化抗體和人抗體的半衰期為數(shù)天、甚至到21天之久。同時，抗體庫的建立和篩選以及多價重組抗體制備技術(shù)的發(fā)展使人們能夠直接獲得特異性強、親和力高的單克隆抗體，如SLAM法(Selected?Lymphocyte?Antibody?Method)制備的抗體的親和力比雜交瘤技術(shù)制備的抗體的親和力提高1000倍。抗體技術(shù)的發(fā)展使導(dǎo)向治療研究走出低谷，并在近幾年取得了突破性進展，應(yīng)用抗體治療疾病初顯曙光(陳志南，劉民培.抗體分子與腫瘤.北京：人民軍醫(yī)出版社，2002)。

但目前對于抗體治療疾病仍存在著兩個難題：一是由于治療疾病的抗體需要量極多，目前的生物工程生產(chǎn)比較困難，同時由于需要量極多，要求其產(chǎn)品純度極高，因此產(chǎn)品生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品價格昂貴。二是對于很多疾病而言，需要抗體長期應(yīng)用，才能達到治療疾病的目的。以美國批準上市的治療腫瘤的人源化抗體Rituxan和Herceptin為例，Rituxan一個療程約需用藥1.2g，Herceptin一個療程約需用藥0.88g；而抗vEGF人源化抗體，一個病人的最大用藥量甚至達到了7.8g，這些抗體類生物制品比細胞因子類生物制品用藥量高出了幾萬倍(黃志偉，王琰.抗體工程.第二版.北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2002)。

在抗體研究中，小分子抗體成為研究的熱點。通過保留抗體上的抗原特異性結(jié)合區(qū)域，構(gòu)建獲得無Fc段、分子量較小、具抗原結(jié)合功能的分子片段的小分子抗體，其易于穿透血管壁和組織屏障進入病灶，有利于腫瘤的診斷和治療；免疫原性強，可作為載體分子偶聯(lián)多種活性蛋白基因如酶、毒素等用于疾病的導(dǎo)向性治療，且不需進行糖基化修飾，可在大腸桿菌中表達。小分子抗體可改善抗體的藥代動力學(xué)特性，并適合于臨床的應(yīng)用。這種經(jīng)改造后的小分子抗體，根據(jù)其價數(shù)的不同可分為單價及多價兩種。單價小分子抗體根據(jù)構(gòu)建的方法不同，可分為Fab抗體、單鏈抗體、二硫鍵抗體、單域抗體和超變區(qū)多肽。在ScFv的基礎(chǔ)上，可以把兩個或兩個以上的ScFv重組在一起，由此可制備成多價的小分子抗體即微型抗體(簡稱多價微抗)。其中包括雙鏈抗體(diabody)，雙特異性抗體(bispecific?antibody)，微型抗體(minibody)，三鏈抗體(triabody)及四鏈抗體(tetrabody)等(李智華.基因工程抗體研究進展.云南醫(yī)藥，2004，(25)1：74-78)。