[發明專利]Cathepsin D抗原多肽、應用及含有該多肽的檢測試劑盒

無效

• 申請號: 200810227252.2
• 申請日: 2008-11-25
• 公開（公告）號: CN101735317A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 婁曉敏;張軍;張聚;呂有勇;徐寧志;劉斯奇
• 申請（專利權）人: 中國科學院北京基因組研究所
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K16/18;G01N33/574;A61K39/395;A61P35/00
• 代理公司: 北京北新智誠知識產權代理有限公司 11100
• 代理人: 程鳳儒

技術領域

本發明涉及一種Cathepsin?D抗原多肽，更具體地說是一種腫瘤標記物CathepsinD抗原多肽，自身抗體在制備檢測腫瘤試劑盒中的應用及含有該多肽的檢測試劑盒，屬于生物工程領域。

背景技術

在我國，肺癌是第一大癌癥，無論是發病率還是死亡率都位居腫瘤之首。近年來肺癌的診斷和治療技術有了很大進步，但是肺癌的五年生存率仍低于15％。目前人類對腫瘤的診斷主要還是依靠影像學和病理學技術手段，患者大多在有明顯占位病變和臨床癥狀后才得以診斷，多數患者已經到中晚期，很難得到有效的治療。而且，現在臨床上缺少對腫瘤發展過程有效的監測指標，從而導致早期診斷困難。因此，尋找并建立肺癌早期及癌前病變的生物標記物，并用其制備診斷試劑盒，一直是肺癌預防和早期診斷的重要研究課題。

隨著分子細胞生物學研究和生物信息學的發展，一些新的技術手段不斷涌現，越來越多組的概念的提出，腫瘤研究也進入了一個新的紀元。人們開始系統腫瘤生物學的研究，希望實現基因、蛋白和生物代謝研究的統一，獲得的大量實驗研究數據將有助于人類認識腫瘤生物學本質，并轉化為腫瘤防治的有效技術手段。

蛋白質組學就是以生物的蛋白質組為研究對象，通過大規模，高通量的分析，企圖從根本上破解生命之謎。近年來，蛋白質組學技術的快速發展與應用，為腫瘤標志物的篩選及早期診斷奠定了堅實的基礎。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種特異性腫瘤標志物Cathepsin?D抗原多肽及其衍生物。

本發明的第二目的在于提供一種特異性腫瘤標志物Cathepsin?D抗原多肽制備的抗體。

本發明的再一個目的是提供該在Cathepsin?D抗原多肽在制備檢測腫瘤試劑盒中的應用。

為了實現上述目的，本發明發明思路為：

本發明利用蛋白質組學技術鑒定并篩選出了與肺癌發生相關的蛋白質Cathepsin?D，并且根據基因序列對其進行了克隆表達，制備了抗體，進一步研究可應用于臨床診斷和研發藥物的靶標。

通過雙向電泳和質譜鑒定的方法，發明人在三個不同代齡的M-BE細胞條件培養基的分泌蛋白中，發現蛋白質Cathepsin?D隨著代齡的增加，其在條件培養基中的含量亦增加。M-BE細胞是正常人支氣管上皮細胞轉染SV40的LT抗原而得到的用生化的細胞系。其隨代齡的增加正趨于惡化，其所表現出的分泌特性可能與肺癌細胞的分泌特性相一致，即，Cathepsin?D可能為肺癌細胞大量分泌。Cathepsin?D已經被報道參與腫瘤的發展和轉移。因此該蛋白在腫瘤細胞條件培養基中的分泌量的差異為進一步揭示腫瘤發展規律提供了新的腫瘤標志物，為今后應用于臨床診斷提供了重要的試驗依據。

為了進一步研究Cathepsin?D蛋白在腫瘤發生過程中的功能和作用，我們根據其基因序列，克隆表達了全長Cathepsin?D蛋白及其多種多肽片段，分別經鎳柱純化。Cathepsin?D全長蛋白及其各種多肽的疏水性較強，我們利用不同濃度的Sarkosyl對Cathepsin?D全長蛋白及其多肽進行變性及復性的純化，最終獲得了純度較高的可溶性Cathepsin?D抗原蛋白采用高純度的抗原免疫兔子，獲得了高效價的多抗，經ELISA和Western?Blotting檢測，證實其特異性和靈敏性。

本發明的具體技術方案：

一種Cathepsin?D抗原多肽，其具有序列表中SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列。首先無血清培養基培養M-BE細胞，從該無血清培養基中提取蛋白質，提取的蛋白質經過Bradford法定量后，采用雙向電泳進行了分離。膠圖分析和質譜鑒定發現了78個代齡相關的差異蛋白質斑點，其中的44個蛋白質斑點隨著代齡的增加著色加深，34個蛋白點表現為隨代齡增加著色減弱。將這78個蛋白點切下，進行酶切消化，經MALDI-TOF和LC-MS/MS質譜鑒定其中的一個為Cathepsin?D。提取培養細胞的總mRNA，以之為模板逆轉錄合成cDNA第一鏈。根據Cathepsin?D全長序列設計引物，引物兩端連入EcoR?I和Xho?I酶切位點：

Forward：5’CCGGAATTCATGCAGCCCTCCAGCCTTCTG??3’

Reverse：5’CCGCTCGAGGAGGCGGGCAGCCTCGGCGAA??3’