[發明專利]一種生產腺苷蛋氨酸的方法

無效

• 申請號: 200810225881.1
• 申請日: 2008-11-05
• 公開（公告）號: CN101736048A
• 公開（公告）日: 2010-06-16
• 發明（設計）人: 徐明波;吳彥卓;陳獻華;秦富景;趙晶晶;劉迎
• 申請（專利權）人: 北京雙鷺藥業股份有限公司
• 主分類號: C12P13/00
• 分類號: C12P13/00;C12N9/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及腺苷蛋氨酸的生產方法。

背景技術

腺苷蛋氨酸(SAM)是存在于人體所有組織和體液中的一種生理活性分子。SAM主要用于治療肝硬化前和肝硬化所致肝內膽汁郁積，妊娠期肝內膽汁郁積，在抗炎止痛、抗精神抑郁、去屑、止癢、減皺、抗衰老等方面也有重要應用。腺苷蛋氨酸在常溫條件下的吸濕性和不穩定性以及生產工藝的復雜性嚴重限制了腺苷蛋氨酸在醫療保健領域的廣泛應用。因此，歐美科技界在腺苷蛋氨酸的穩定成鹽和生產工藝方面申報了多項專利。藥物原料市場上具有代表性的一些專利有：如美國專利6635615，5102791、4028183、4369177、4764603等。

SAM的全國年需求量至少在10噸以上，全球的需求每年為50噸。SAM在我國還沒有實現國產化，全部依賴進口。SAM主要生產廠商集中在德國和意大利，藥用原料每千克約8000元人民幣。國內已有開發研究工作，因發酵法的表達水平低，酶促轉化法的酶和ATP的成本很高，所以原料生產至今未能大規模產業化，主要由雅培公司進口中國。

目前腺苷蛋氨酸工業化生產工藝主要有酵母發酵法(胞內表達法)和酶促轉化法(胞外酶促法)兩種，這兩種方法都存在著不同的技術難點：

酵母發酵法(胞內表達法)：國外多采用特殊培育的表達SAM的釀酒酵母菌株通過胞內表達制備SAM。國內有人研究出基因工程改構的釀酒酵母，發酵表達SAM，但目前表達最高的也只達到8g/L發酵液，而且大多只完成發酵工藝的探索，用此法生產是在胞內表達，由于SAM的前體L一蛋氨酸需透過胞壁，且受胞內空間的限制所以表達產量很難提高，收率低，成本高，不適合大規模制備。

酶促法(胞外酶促法)：酶促法多以從啤酒酵母或其他工程菌中提取純化腺苷蛋氨酸合成酶，然后通過優化酶促反應條件來轉化制備SAM，該法原料轉化率高，SAM易于提取純化，但是該法中酶的提取純化工序復雜在酵母菌的破碎、離心、過濾、濃縮上清液及上清液上柱純化中會有酶的損失，同時影響酶活性的不確定因素較多，純化酶的周期較長，致使酶的活性受到了影響，同時該法獲得的純化酶量較少，導致酶的成本很高，也不適合大規模制備SAM。

發明內容

本發明提供一種胞內表達加胞外酶促合成生產腺苷蛋氨酸的方法。以解決酵母發酵法(胞內表達法)表達產量低，收率低，成本高，和胞外酶促法酶的成本高，不適合大規模制備SAM的問題。本發明集中了發酵法(胞內表達法)和胞外酶促法的優點，利用一次發酵可同時獲得胞內表達和胞外酶促兩部分SAM產物，大大提高了單位發酵液SAM的產量，低了生產成本，使SAM實現大規模生產制備。

本發明采取的技術方案是：

首先利用基因工程技術獲得表達SAM的高效基因工程菌：

SAM合成酶基因SAM2的核苷酸編碼序列長1152bp，編碼含384氨基酸殘基的亞基，分子量為42300。SAM1和SAM2編碼序列的同源性為83％，所編碼的多肽氨基酸序列的同源性高達92％，說明SAM1和SAM2為復制基因。將SAM2基因整合至基因工程菌株中。將帶有強啟動子、SAM2基因和終止子序列的基因片段依靠SAM2兩端的同源序列臂整合在原基因組SAM2位點處，依靠強啟動子作用實現SAM2的高表達。

接著利用發酵技術發酵，在工程菌中表達SAM，通過破胞提取胞內的SAM合成酶和SAM。

然后利用胞內提取的SAM合成酶再在胞外進行胞外酶促合成反應生產SAM，這樣利用一次發酵可同時獲得胞內的表達SAM和SAM合成酶，SAM合成酶再在胞外進行胞外酶促合成反應，又生產一部分SAM。即一次發酵可同時獲得胞內胞外兩部分SAM產物，大大提高了單位發酵液的產量，降低了生產成本，使SAM實現大規模生產制備。

其中獲得的胞內表達部分達到：每升發酵液中為20.6g，生物量110g/L。胞外酶促生產部分達到：重組腺苷蛋氨酸合成酶純酶比活性高達10-50lU/毫克。酶促反應轉化率達95％以上。每升酶促反應液中SAM濃度達為12.8g。

本發明中的啤酒酵母基因重組工程菌，該菌種由我公司通過基因重組工程技術構建選育，由我公司技術中心保藏，保藏日期2008年3月18日，本基因重組啤酒酵母菌攜帶化學合成腺苷蛋氨酸合成酶基因。合成酶的表達受啟動子TAC調控。

本發明中的工程菌破碎工藝是采用物理方法破碎的：細胞破碎儀、高效勻質機等。

本發明中的腺苷蛋氨酸合成酶是通過截留分子量為3000的中空纖維超濾柱超濾濃縮提取的，收率達到90％以上。腺苷蛋氨酸合成酶是可以回收多次重復利用的。