[發明專利]小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經性疼痛藥物的應用

無效

• 申請號: 200810225756.0
• 申請日: 2008-11-11
• 公開（公告）號: CN101555476A
• 公開（公告）日: 2009-10-14
• 發明（設計）人: 馮澤國;吳小兵;陳娜;張砡;李冠華;王維
• 申請（專利權）人: 馮澤國;吳小兵;陳娜
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/68;A61K31/7088;A61P25/04
• 代理公司: 北京凱特來知識產權代理有限公司
• 代理人: 趙鎮勇

技術領域

本發明涉及一種治療神經性疼痛藥物的制備技術，尤其涉及一種小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經性疼痛藥物的應用。

背景技術

N型電壓依賴性鈣通道(VDCCs)在疼痛的傳遞與調控中具有重要作用。它們密集分布于脊髓背角傷害感受性神經元突觸前末梢，參與主要疼痛介質如谷氨酸和P物質等釋放的調節。

RNA干擾(RNA?interference，RNAi)現象是指內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導細胞內的mRNA發生特異性降解，導致靶基因的表達沉默，產生相應的功能表型缺失，屬于轉錄后的基因沉默機制。近年，隨著對RNA干擾現象機制的深入研究，RNAi已經成為一種功能基因組研究的有效工具。

在N型VDCCs的Cav2.2mRNA中存在兩種外顯因子，一種是e37a；另一種是e37b。e37a和e37b為人、大鼠、小鼠共有的保守基因序列，均為97個核苷酸。其中，外顯子e37a特異地表達于背根節神經元，而不表達于脊髓、延髓、中腦、小腦、丘腦、海馬及大腦皮層；另一種外顯子e37b在上述所有組織中均表達。

現有技術中，由于e37a與e37b兩個外顯子的序列之間具有同源性，僅存在微小差距，此兩個外顯子編碼的氨基酸僅相差14個，因此，臨床應用的N型VDCCs阻斷劑，如ω—Ctx等，在治療疼痛時，對e37a和e37b均能產生沉默效應。

上述現有技術至少存在以下缺點：

副作用較大，如容易抑制交感神經緊張性，引起體位性低血壓、心率減慢等；抑制中樞突觸傳遞(包括興奮性和抑制性突觸傳遞)，引起共濟失調、眩暈、幻覺、精神錯亂、惡心、嘔吐、眼球震顫等癥狀。

發明內容

本發明的目的是提供一種副作用較小的小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經性疼痛藥物的應用。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明的小干擾RNA，該小干擾RNA的序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。

本發明的上述的小干擾RNA的篩選方法，包括步驟：

A、對照EGFP報道基因和Cav2.2e37a基因序列設計EGFP-e37a引物，并通過該引物構建EGFP-e37a融合基因；

所述EGFP-e37a引物包括：

L?5’GAA?TTC?CGC?CAC?CAT?GGT?GAG?CAA?GGG?3’；

R1?5’ AGC?CAA?CGG?GTG?GCG?CAA?TAC?AAC?GCA?ACA?AAC?TGT?ACA?TAT?CCT?TAT?AATGAA?TCC?GGC?AAC?TTG?TAC?AGC?TCG?T

R2?5’AGA?TCT?TTA?CTT?GTA?GGC?CAA?CCT?ACG?AGG?GCA?GTT?CTT?CCC?TAA?GCC?AACGGG?TGG?CG?3’；

所述EGFP-e37a融合基因包括：

5’GAATTC—EGFP報道基因—Cav2.2e37a基因—AGATCT3’；

B、設計多對小干擾RNA，分別用所述多對小干擾RNA與所述EGFP-e37a融合基因進行RNA干擾試驗；

C、檢測所述RNA干擾試驗效果，選擇使所述EGFP-e37a融合基因受到干擾的程度符合設計要求的小干擾RNA。

本發明的上述的小干擾RNA制備治療神經性疼痛藥物的應用，該小干擾RNA用于制備治療神經性疼痛的藥物。

由上述本發明提供的技術方案可以看出，本發明所述的小干擾RNA及篩選方法及制備治療神經性疼痛藥物的應用，由于首先對照EGFP報道基因和Cav2.2e37a基因序列設計EGFP-e37a引物，并通過PCR、酶切的方法構建EGFP-e37a融合基因，然后通過干擾試驗篩選出序列為CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干擾RNA，該小干擾RNA僅對外顯子e37a產生沉默效應，用該小干擾RNA制備的治療神經性疼痛的藥物，副作用小。

具體實施方式

本發明的小干擾RNA(siRNA)，其較佳的具體實施方式是，該siRNA的序列為：CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。

本發明的上述的小干擾RNA的篩選方法，其較佳的具體實施方式是，包括步驟：

步驟A、首先，對照EGFP報道基因和Cav2.2e37a基因序列設計EGFP-e37a引物，并通過該引物構建EGFP-e37a融合基因；

所述EGFP-e37a引物包括：

L?5’GAA?TTC?CGC?CAC?CAT?GGT?GAG?CAA?GGG?3’；