[發明專利]用于亞歐型口蹄疫病毒檢測的實時熒光PCR引物和探針

有效

• 申請號: 200810225343.2
• 申請日: 2008-10-30
• 公開（公告）號: CN101724711A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 林祥梅;吳紹強;韓雪清;梅琳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛

技術領域

本發明屬于流行病學和食品衛生檢測領域，具體而言，本發明 涉及用于亞歐型口蹄疫病毒檢測的實時熒光PCR引物和探針，以及 使用其進行檢測的方法，更具體地說，是對豬、牛、羊等偶蹄類動 物及相關動物產品中是否攜帶A、O、C以及Asia1型口蹄疫病毒進 行檢測的通用實時熒光PCR引物和探針，以及使用其進行檢測的方 法。

背景技術

口蹄疫(Foot-and-mouth?disease，FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth?disease?virus，FMDV)感染引起的偶蹄動物共患的 急性、熱性、高接觸性傳染病(江鵬斐等，1999)，同時也是一種 嚴重的“政治經濟病”，列為OIE規定的A類傳染病之首，同時也 是動物及動物產品國際貿易中重要的檢疫對象(董志強等，2007)。 目前，ELISA及病毒分離是OIE推薦的檢測方法，存在操作時間長 (病毒培養需要4d時間)、敏感性低(ELISA敏感性只有70％-80％) 等缺點(花群義等，2005)。

熒光PCR(FQ-PCR)技術是美國PE(Perkin?Elmer)公司1995 年研制出來的一種新的核酸定量技術，該方法自產生以來，不斷發 展完善，特別是隨著TaqMan探針的廣泛使用，到目前為止該技術 已經非常成熟，具有靈敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特異 性強(在普通PCR一對引物的基礎上，中間還設計有探針，只有引 物和探針均完全配對，才可能得到擴增，可對少至2個核苷酸的序 列差異進行鑒定，從而保證了反應的特異性)、操作安全方便(無須 凝膠電泳，避免了EB染色對人體的危害)等優點，目前已被廣泛 應用于細菌、病毒等病原體檢測、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因 表達、突變及其多態性的研究等多個領域。

目前，國內外建立了很多FMDV通用型熒光RT-PCR檢測方法。 但現有資料表明作為RNA病毒，FMDV在復制過程中由于缺乏校對 機制，基因組每復制一次，就有0.1-10個核苷酸發生變異(Gu等， 2007)。在不同的生存環境、免疫壓力等條件的誘導下，基因組特別 是結構蛋白編碼區核苷酸變異的幾率更高，很難選擇在蛋白編碼區 設計引物/探針，建立通用型熒光RT-PCR檢測方法。同時研究表明， FMDV的七個血清型即O、A、C、亞洲1(Asia1)型、南非1、2、 3型(SAT1、SAT2、SAT3)可用核酸雜交分成兩群，O、A、C和 亞洲1型為亞歐型FMDV，南非1、2、3型為南非型FMDV，群內 各型核酸同源性達60％-70％，但兩群之間僅為25％-40％(盧曾軍， 2003)，因此目前還很難設計出特異性較高的亞歐型及南非型均通用 的熒光RT-PCR引物與探針。

針對目前我國尚無南非型口蹄疫疫情的現狀，本發明在對 FMDV大量基因信息進行分析比較的基礎上，選擇亞歐型口蹄疫病 毒高度保守的5′-UTR(非翻譯區)設計引物和探針，建立了亞歐型 FMDV特異的熒光RT-PCR檢測方法，從而可大大提高口蹄疫病毒 PCR檢測方法的通用性，滿足我國相關動物及動物產品的口蹄疫檢 測及監測需求。

發明內容

本發明目的在于提供用于亞歐型口蹄疫病毒檢測的熒光PCR引 物和探針序列。

本發明的目的通過下述技術方案實現：從GenBank中獲得口蹄 疫病毒(FMDV)基因組序列，應用MegAlign軟件對上述序列進行 比較和一致性分析，選擇較為保守的5′-UTR(非翻譯區)序列，根 據引物和探針的設計原則，用軟件Beacon?Designer7.0在這些序列 的保守區域篩選到一對具有通用堿基序列的通用引物，引物對經在 線序列BLAST分析，確定為亞歐型FMDV(包括A、O、C以及 Asia?1型)區別于南非型FMDV(包括SAT-1、SAT-2、SAT-3型) 的特異性引物對。在該引物對的擴增區域內設定一條通用的熒光 TaqMan探針，報告熒光染料標記在探針的5’端，淬滅熒光染料標記 在探針的3’端，兩者構成能量轉移結構，即報告熒光染料所發射的 熒光可被淬滅熒光染料吸收，當二者距離變遠時，抑制作用減弱， 報告熒光染料信號增強。在擴增反應過程中，探針同DNA模板上的 目的擴增片段雜交，由于Taq酶具有5’端到3’端的外切酶活性，在 擴增延伸階段將探針切斷，探針被水解，從而導致報告熒光基團和 淬滅熒光基團距離變遠，淬滅熒光染料的抑制作用消失，報告熒光 信號得以釋放出來而被儀器檢測到，從而實現對亞歐型FMDV的檢 測。