[發明專利]一種帶有免疫標記的羊種布魯氏菌的重組菌及其應用

有效

• 申請號: 200810224817.1
• 申請日: 2008-10-22
• 公開（公告）號: CN101386830A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 吳清民;牛建蕊;劉文娟;任婕;李娜;張興林;楊羽;劉文曉;王真;張春燕
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;A61K39/10;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司
• 代理人: 關 暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種帶有免疫標記的羊種布魯氏菌的重組菌及其應用。

背景技術

布魯氏菌病是一種人畜共患的傳染病，也是大動物傳染病中僅次于口蹄疫，具有重要的政治、經濟影響力的疾病，在世界各國的流行形勢十分嚴峻。長期以來全球防控布魯氏菌病的策略主要是檢疫-撲殺(發達國家)或免疫接種(發展中國家)，前者通過檢疫撲殺患病的牛、羊、豬等動物，耗資巨大、操作困難；后者通過免疫接種并輔助撲殺措施，雖可阻止疾病在動物群中的傳播，但免疫動物和臨床患病動物難以鑒別，使患病動物在自然群體中長期存在，嚴重威脅人類和動物群的健康，阻礙動物中布魯氏菌病的根除和凈化。

發明內容

本發明的目的是提供一種羊種布魯氏菌的重組菌。

本發明提供的羊種布魯氏菌的重組菌，是將羊種布魯氏菌(Brucellamelitensis)基因組中的0抗原輸出系統ATP結合蛋白的編碼基因滅活后得到的重組菌。

所述羊種布魯氏菌(Brucella?melitensis)可為現有的菌株，如野生株(包括標準株和強毒株)、疫苗株。

所述0抗原輸出系統ATP結合蛋白可為任何羊布魯氏菌(Brucella?melitensis)的0---抗原輸出系統ATP結合蛋白，如為序列1所示的0抗原輸出系統ATP結合蛋白。

所述0---抗原輸出系統ATP結合蛋白的編碼序列為序列表中序列2所示的核苷酸序列。

可通過任何現有滅活方法滅活所述羊種布魯氏菌(Brucella?melitensis)中的0抗原輸出系統ATP結合蛋白，如缺失基因組中該蛋白的編碼序列、插入外源或內源序列、同源重組、RNA干擾等。

所述同源重組是將DM14的DNA片段導入所述羊種布魯氏菌(Brucella?melitensis)中實現的；所述DM14的DNA片段，從上游至下游依次為同源臂DM14-1和同源臂DM14-2；所述同源臂DM14-1和同源臂DM14-2能與所述羊種布魯氏菌基因組中0抗原輸出系統ATP結合蛋白編碼基因的上游序列和下游序列發生同源重組，滅活所述0抗原輸出系統ATP結合蛋白的編碼基因。

所述同源臂DM14-1和同源臂DM14-2的長度均為400-600bp。

所述同源臂DM14-1具體可為以羊種布魯氏菌16M(Brucella?melitensis16M)標準株的基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR擴增得到的DNA片段：

pWUM393(上游引物)：5’-GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG-3’；

pWUM394(下游引物)：5’-CTGCAGTGGCTGGATCATAGGTA-3’。

所述同源臂DM14-2具體可為以羊種布魯氏菌16M(Brucella?melitensis16M)標準菌株的基因組DNA為模板，用如下引物進行PCR擴增得到的DNA片段：

pWUM395(上游引物)：5’-AGCCACTGCAGGAGATTCAGGCGCTCCA-3’；

pWUM396(下游引物)：5’-CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC-3’。

實驗證明，所述重組菌的毒力低于出發菌株，而且具有血清學診斷標記，其免疫保護效力與現有的疫苗株相當。因此，該重組菌可用于開發羊種布魯氏菌疫苗。

該布魯氏菌疫苗，其活性成分為上述羊種布魯氏菌的重組菌。

本發明通過對布魯氏菌基因組中的功能基因進行篩選，發現0抗原輸出系統ATP結合蛋白編碼基因的滅活可使羊種布魯氏菌的毒力顯著降低，同時可以改變菌株免疫后動物血清中的抗體組成。本發明通過將羊種布魯氏菌的0抗原輸出系統ATP結合蛋白的編碼基因滅活，得到了新的菌株，與出發菌株相比，該新菌株的毒力較小，無需滅活就可以作為疫苗免疫動物，而且可以使免疫接種動物和臨床患病動物通過血清學技術鑒別出來。使用本發明的菌株免疫小鼠，小鼠體內能夠產生與標準菌株、現有疫苗菌株不同的免疫反應狀態，通過動物血清的免疫學檢測能夠將患病動物從免疫動物群體中鑒別出來。本發明對布魯氏菌病疫苗的改造、診斷鑒別試劑的研制，開發布魯氏菌基因缺失標記疫苗和配套的鑒別診斷試劑，促進全球動物布魯氏菌病的根除和凈化具有十分重要的意義。

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。

附圖說明

圖1為DM14-1和DM14-2的PCR擴增結果

圖2為DM14片段的PCR鑒定結果

圖3為重組質粒pEX18AP-DM14轉化大腸桿菌后的PCR鑒定結果