[發(fā)明專利]一種防止聚合酶鏈式反應(yīng)污染的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810224369.5
• 申請日: 2008-10-20
• 公開（公告）號: CN101724671A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 白志輝;谷立坤;張建云;鄒國;李祖明
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種防止聚合酶鏈式反應(yīng)污染的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase?Chain?Reaction，PCR)，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程，其本質(zhì)是一項DNA體外合成放大技術(shù)，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。目前，PCR技術(shù)可用于基因分離克隆，序列分析，基因表達調(diào)控，基因多態(tài)性研究等許多方面，同時，聚合酶鏈式反應(yīng)也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于病原微生物檢測，微生物群落結(jié)構(gòu)監(jiān)測等方面。如中國專利(專利號：03137645.2)公布了一種提高PCR技術(shù)檢測植物病原細菌靈敏度的方法；中國專利(專利號：01104063.7)公開了一種聚合酶鏈式反應(yīng)基因芯片，用于病原微生物的鑒定；中國專利(專利號：02136206.8)公開了一種應(yīng)用于微生物分子生態(tài)學的并行比較為生物群落結(jié)構(gòu)的分子生態(tài)監(jiān)測方法。

在上述應(yīng)用過程中，PCR擴增過程中出現(xiàn)污染將導致假陽性結(jié)果或假陰性結(jié)果，是一個亟待解決的問題。PCR污染的原因是多方面的，反應(yīng)體系中成分的污染是主要原因之一，目前已經(jīng)有一些方法加以預(yù)防，主要是采用環(huán)境消毒，操作中注意交叉污染等，如中國專利(專利號：02133044.1)公布了一種利用鹽酸蒸汽消滅核酸污染的方法，該方法主要用于消除實驗儀器、器皿、耗材、實驗場地等引起的核酸污染，從而降低PCR過程出現(xiàn)污染的機會。這類方法可以有效控制PCR操作過程中可能出現(xiàn)的污染，但PCR體系中的不同成分都是要多次使用的，任何一次微小的失誤從而引入外界微生物都可能造成結(jié)果的錯誤。

抗生素也稱抗菌素，可以抑制或殺死其他微生物。由于不同種類的抗生素的化學成分不一，因此它們對微生物的作用機理也很不相同，有些抑制蛋白質(zhì)的合成，有些抑制核酸的合成，有些則抑制細胞壁的合成。抗生素被廣泛應(yīng)用于家禽、家畜、作物等病害的防治，現(xiàn)已成為治療傳染性疾病的主要藥物。抗生素還應(yīng)用于食品保存，如四環(huán)素應(yīng)用于肉類等的保存，制霉菌素應(yīng)用于柑桔等的保存。

目前，通過向PCR反應(yīng)的不同成分中加入抗生素，減少PCR出現(xiàn)污染的機會，未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種防止聚合酶鏈式反應(yīng)污染的新方法。

發(fā)明原理：PCR反應(yīng)體系中的緩沖液、dNTP溶液、無菌水在保存前加入一定量抗生素，避免多次凍融過程中由于引入環(huán)境微生物，造成微生物在緩沖液、dNTP溶液、無菌水中繁殖，從而引起PCR污染，造成PCR結(jié)果錯誤。體系中加入抗生素可以抑制微生物的生長、繁殖，避免或減少外來微生物的污染。

實施方法：

1、稱取一定量的抗生素，溶解于超純水中，配制成母液，過濾除菌，分裝于無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存。

2、無菌操作吸取一定量母液加入PCR反應(yīng)體系中的緩沖液、dNTP溶液、無菌水中，冷凍保存。

步驟一中所述抗生素可以是青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、新霉素、核糖霉素、小諾霉素、阿斯霉素、四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素、氯霉素、甲砜霉素、紅霉素、白霉素、無味紅霉素、乙酰螺旋霉素、麥迪霉素及交沙霉素中一種或多種的混合物，母液中各種抗生素混合后的總濃度為1μg/ml-20mg/ml。

步驟二中保存的各種PCR成分中，各種抗生素的總濃度為0.01μg/ml-100μg/ml。

本發(fā)明技術(shù)方案可以防止PCR反應(yīng)體系受到外來微生物的污染，延長使用次數(shù)。以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施，目的在于幫助讀者更好地理解本發(fā)明的精神實質(zhì)，但不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。

實施例1：

1)稱取一定量的青霉素，溶解于超純水中，配制成母液1mg/ml，過濾除菌，分裝于無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存。

2)處理管為無菌操作吸取一定量母液加入PCR反應(yīng)體系中的dNTP溶液中，青霉素終濃度為1μg/ml，對照管為同樣條件下加等量無菌超純水，冷凍保存。

3)正常PCR操作，對照管反復(fù)凍融5次后PCR結(jié)果表現(xiàn)為污染，而處理管反復(fù)凍融11次后PCR結(jié)果仍表現(xiàn)為無污染。

實施例2：

1)稱取一定量的四環(huán)霉素，卡那霉素，分別溶解于超純水中，各配制成母液2mg/ml，過濾除菌，分裝于無菌的離心管中，冷藏或冷凍保存。