[發明專利]PIK3CA基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法

有效

• 申請號: 200810220266.1
• 申請日: 2008-12-23
• 公開（公告）號: CN101445832A
• 公開（公告）日: 2009-06-03
• 發明（設計）人: 許嘉森;郭元杰
• 申請（專利權）人: 廣州益善生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司
• 代理人: 萬志香;曾旻輝

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體的是涉及PIK3CA基因突變的檢測探針、液相芯片及其檢測方法。

技術背景

PIK3CA基因是逆轉錄病毒v-p3k癌基因在細胞內的同系物，編碼I_A類磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol?3-kinases，PI3Ks)的p110α催化亞單位。I類PI3Ks是由一個p110催化亞單位和一個p85調節亞單位組成的異源二聚體，可受表皮生長因子受體(epidermal?growth?factor?receptor，EGFR)、胰島素受體等受體酪氨酸激酶的激活。活化的P?I3Ks磷酸化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸[phosphatidylinositol?4，5-bisphosphate，PI(4，5)P2]，生成細胞內的重要第二信使——磷脂酰肌醇(3，4，5)三磷酸(phosphatidyli-3，4，5-triphosphate，PIP3)。PIP3可激活AKT通路，從而產生廣泛的生物學效應，包括調節細胞增殖、存活和細胞周期調控等，涉及mTOR(target?of?rapamycin)、BAD、Caspase9、Tuberin、GSK3β和FH(fork?head)轉錄因子家族亞群等眾多的靶分子。

對PI3K家族全部16個成員的激酶結構域外顯子編碼區域進行序列分析顯示，PIK3CA是唯一被發現由體細胞突變引起致癌的基因。進一步的研究指出，大部分PIK3CA基因突變集中在螺旋結構域和催化結構域，被稱為PIK3CA基因突變的“熱點”。最新的研究表明，PIK3CA基因突變可發生在包括乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌、肝癌、胃癌等多種惡性腫瘤細胞中。目前，PI3K通路已經成為各大醫藥公司開發抗腫瘤小分子抑制劑的主要靶標，而PIK3CA基因也成為了腫瘤診斷及治療的主要靶點。目前，Quinolone、Pyridopyrimidine、Imidazopyridine等藥物均是根據PIK3CA靶點和相應的PI3K通路而開發的。然而，由于PIK3CA在腫瘤細胞中存在的突變的高頻性，各種針對EGFR基因以及PI3K通路而開發的藥物療效存在著個體差異。Maruyama等研究報道，存在PIK3CA基因突變的患者其預后更為積極。而有的研究者則指出，在乳腺癌中，PIK3CA中不同的基因突變位點其預后也不同。外顯子9(螺旋結構域)上的突變的患者預后比野生型個體要差，而外顯子20(催化結構域)上的突變相對與野生型個體具有積極的預后。盡管PIK3CA基因突變對腫瘤患者的治療預后的尚未定論，但這些研究都提示著PIK3CA基因突變是影響預后的一個重要因素。因此，對腫瘤患者尤其是乳腺癌患者，進行PIK3CA基因突變的檢測是實現腫瘤個體化治療，讓患者最大程度的受益就顯得十分必要了。

當前，國內外進行PIK3CA基因突變檢測的主要方法是進行組織DNA樣本的直接測序。直接測序法具有直接和直觀等優點，能夠確切的了解PIK3CA基因突變的位點和類型，然而，直接測序法存在著靈敏度差和效率低等問題，嚴重的影響了其在臨床上的應用。由于腫瘤組織存在著異質性的問題，即使存在PIK3CA基因突變的患者樣本中也含有大量的野生型基因，從而干擾了PIK3CA基因突變的有效檢出，目前直接測序法可以達到的檢測的靈敏度大概為15％-25％；同時，直接測序法難以實現高通量的檢測，其時效性嚴重的制約了其在臨床診斷中推廣。國際上最先進的檢測PIK3CA基因突變的技術是采用位點特異的熒光定量PCR，該方法的優勢在于提高了檢測靈敏度和檢測的時效性。但實時熒光定量PCR檢測技術本身存在著假陽性率高亦即特異性差的問題，也為臨床診斷所詬病。

因此，PIK3CA基因突變的檢測要成為一項臨床常規檢測技術，必須建立一種靈敏度高、特異性好并且能夠實現高通量檢測的簡便易行的檢測新技術，是各級醫院都有條件開展這一基因診斷項目。

發明內容

本發明的目的在于提供用于PIK3CA基因突變檢測的探針，以及應用這些探針所制備的PIK3CA基因突變檢測液相芯片。該液相芯片可用于檢測PIK3CA基因外顯子9和/或外顯子20上的相關突變，從而為臨床治療提供參考。

實現上述目的的技術方案如下：

用于PIK3CA基因突變檢測的探針：包括有