[發明專利]一種轉基因畢赤酵母工程菌株及其構建方法

有效

• 申請號: 200810220126.4
• 申請日: 2008-12-18
• 公開（公告）號: CN101440353A
• 公開（公告）日: 2009-05-27
• 發明（設計）人: 孫國萍;張培培;任隨周;許玫英
• 申請（專利權）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/53;C12N15/81;C12R1/84
• 代理公司: 廣州科粵專利代理有限責任公司
• 代理人: 余炳和

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種轉基因畢赤酵母工程菌株及其構建方法。

背景技術：

三苯基甲烷類染料是僅次于偶氮染料的一大類染料，應用廣泛，由于其具有生物毒性及致癌、致畸、致突變的“三致”作用已嚴重威脅到人類健康及生態平衡。其中的孔雀石綠更是由于曾被廣泛用作水產養殖的防霉劑導致在水體及魚體中殘留而引起世人的廣泛關注。

近年對印染廢水的物理、化學及生物處理方法進行了多方面的研究，已取得一定的進展。物理、化學方法主要包括以無機和有機高分子絮凝劑為主的絮凝法，以臭氧、H₂O₂和Fenton試劑、Cl₂O為主的氧化法，利用氧化還原、電凝聚及電氣浮等作用的電化學法，利用光催化氧化法的光化學法，利用吸附劑的吸附法和利用超濾或反滲透技術的膜分離法等。這些方法均有成本高和造成二次污染等缺點。

嗜水氣單胞菌Aeromonas?hydrophila?subsp.DN322是從印染廢水處理廠的活性污泥中分離到的一株對結晶紫、堿性品紅、燦爛綠及孔雀綠等多種三苯基甲烷類染料具有高效脫色能力的嗜水氣單胞菌。從該菌中分離到一種新的三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD基因，三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD蛋白分子量為58.8kDa，等電點為5.6。酶蛋白是由兩個相同分子量的亞基組成的二聚體，每個亞基的分子量為29.4kDa。該酶能夠催化結晶紫、堿性品紅、燦爛綠及孔雀石綠等多種三苯基甲烷類染料脫色降解，對底物具有結構專一性。脫色酶TpmD催化的脫色反應依賴于分子氧和輔酶NADH或NADPH的存在，屬于NADH/NADPH依賴型的氧化酶類。酶的分子結構中含有血紅素卟啉環，催化活性受細胞色素P450特異性抑制劑的強烈抑制，催化反應中有自由基的參與，這三方面特性與P450單加氧酶十分相似，但光譜特征上卻沒有典型P450單加氧酶在450nm處所特有的特征吸收峰(“細菌脫色酶TpmD對三苯基甲烷類染料脫色的酶學特性研究”，任隨周，郭俊，王亞麗，岑英華，孫國萍微生物學報，第46卷第3期，第385～389頁，2006年4月)。

發明內容：

為了充分發揮嗜水氣單胞菌DN322三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD在三苯基甲烷染料染料治理中的作用，實現該酶的大規模產業化應用，首先要實現該酶的大量、穩定表達，并可分泌到胞外。但是嗜水氣單胞菌對魚類、蛙類具有潛在的致病性從而限制了該菌株在環境生物修復中的廣泛應用。而畢赤酵母表達系統是近年來發展起來的一種高效的真核表達系統，它具有表達量高、穩定性好、酶活性高、能分泌至胞外、便于工業化生產等優點，因而可用于酶制劑的產業化發酵生產。

基于上述發明構思，本發明的目的是提供了一種能胞外分泌三苯基甲烷類染料脫色酶，裂解三苯基甲烷類染料骨架結構，進行氧化脫色的轉基因畢赤酵母工程菌株及其構建方法。

本發明通過下述方案予以實現的：

本發明所述的轉基因畢赤酵母基因工程菌株，是將嗜水氣單胞菌DN322中的三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD基因，其DNA序列如SEQ1所示，編碼的蛋白序列三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD如SEQ2所示，與表達載體連接后導入畢赤酵母Pichia?pastoris?X-33，構建而成的轉基因工程菌，該菌能胞外分泌三苯基甲烷類染料脫色酶。

所述轉基因畢赤酵母基因工程菌株的構建方法，其步驟如下：

a)從嗜水氣單胞菌DN322克隆三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD基因；

b)將三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD基因與表達載體pPICZaA載體連接，構建質粒pPICZaA-tpmD；

c)將構建的質粒pPICZaA-tpmD酶切線性化后，導入畢赤酵母菌Pichia?pastoris?X-33中；

d)測定三苯基甲烷類染料脫色酶TpmD基因轉化進入了畢赤酵母菌Pichia?pastoris?X-33中，從而得到轉基因畢赤酵母基因工程菌株。

本發明所構建的工程菌的活性測定是通過將工程菌經甲醇誘導表達后，通過對三苯基甲烷類染料的脫色來測定的。