[發(fā)明專利]一種魚類病原菌海豚鏈球菌分子診斷試劑盒及檢測方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810220112.2
• 申請日: 2008-12-18
• 公開（公告）號: CN101586157A
• 公開（公告）日: 2009-11-25
• 發(fā)明（設計）人: 李安興;周素明;樊媛
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/14
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及水產(chǎn)動物的一種病原的檢測技術，具體涉及一種養(yǎng) 殖魚類致病菌海豚鏈球菌(Streptococcus?iniae)的分子診斷試劑盒及 檢測方法。

背景技術

海豚鏈球菌(Streptococcus?iniae)病是一種重要的魚類細菌病，常 在羅非魚、鱸魚等養(yǎng)殖魚類中引起爆發(fā)性魚病，導致魚群大量死亡。 再者，海豚鏈球菌還可以通過傷口感染人，已被確立為新型人畜共患 病原。盡管如此，海豚鏈球菌在鑒定上卻存在很多問題。首先，海豚 鏈球菌發(fā)現(xiàn)較晚，于1976年才得以定種，因此很多商品化的生化鑒 定系統(tǒng)并沒有將該菌列入其中，如比較著名的生化鑒定系統(tǒng) BioMerieux?Vitek、Microscan、Vitek和ATB?Expression?system等等。 而在Roach?2006年的研究中，用Biolog?GP生化鑒定系統(tǒng)，僅能準確 鑒定出19/25的海豚鏈球菌菌株(Roach?et?al，2006，J?Microbiol Methods，27：20-26)。因此僅依靠生化鑒定的方法來鑒定海豚鏈球菌 極不可靠，特別是在人類臨床，極有可能被誤診為其他更為常見的人 類病原鏈球菌如S.dysgalactiae?subsp.equisim?ilis或S.uberis等。而 現(xiàn)代分子生物學技術的發(fā)展特別是核酸序列測定、聚合酶鏈式反應 (polymerase?chain?reaction，PCR)及其衍生的一些技術為水產(chǎn)動物疾 病的診斷帶來了革命性的變化。目前，用于特異鑒定海豚鏈球菌病的 一些靶序列包括16S?rDNA、ITS序列以及乳酸氧化酶基因。在Mata 等的研究中，以16S?rDNA為靶序列的特異引物在鑒定過程中，不能 將魚類無乳鏈球菌和海豚鏈球菌分開來(Mata?et?al.，2004，Vet Microbiol，101：109-116)。這種情況的發(fā)生可能與16S?rDNA基因的 特點有關，它過于保守，而在相近種中序列差異性不大，以致產(chǎn)生以 上情況。同樣，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)Mata所用引物在其推薦擴增條 件下對不同的中國海豚鏈球菌菌株進行擴增時，有一些菌株出現(xiàn)多條 擴增條帶。此外，在我們還發(fā)現(xiàn)1998年Berridge等設計的一對引物 在用于鑒定我們采集的中國株時，全部呈陰性，即沒有擴增條帶。而 且也不能將它的文章中所描述的標準株擴增出陽性片段。鑒于以上種 種問題，我們通過對國外標準株及中國的不同海豚鏈球菌分離菌株的 一段保守序列ITS進行測序比對，重新設計了一對引物，經(jīng)檢測對海 豚鏈球菌不同菌株均具有較高靈敏度及特異性。另外，通過對各種實 驗條件的優(yōu)化，使得所設計引物能夠直接對感染的魚體組織進行檢測， 并將檢測步驟規(guī)范化，從而達到簡單快速特異的特點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定養(yǎng)殖魚類致病菌海豚鏈球菌 (Streptococcus?iniae)的分子診斷試劑盒及檢測方法，以實現(xiàn)對海豚鏈 球菌的準確、標準化檢測，為健康養(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

本發(fā)明的一種魚類病原菌海豚鏈球菌分子診斷試劑盒及檢測方 法包括下列部件：

(1)感染組織裂解buffer?A，1管，內(nèi)裝感染組織總DNA提取裂解

buffer：20mM?Tris-HCl，5mM?EDTA?Na₂，400mM?NaCl，1％ SDS，pH8.0；

(2)DNA提取B液，1管，內(nèi)裝蛋白酶K(10mg/ml)；

(3)DNA提取C液，1管，內(nèi)裝酚-氯仿-異戊醇(25∶24∶1)；

(4)DNA提取D液，1管，內(nèi)裝異丙醇；

(5)陽性模板對照E液，1管，內(nèi)裝海豚鏈球菌基因組DNA；

(6)PCR反應液F液，1管，內(nèi)裝PCR擴增反應液，包括ddH₂O、 含Mg²⁺的10×Buffer、dNTP、引物P1、引物P2和TaqE；

(7)盒子。

上述魚類病原菌海豚鏈球菌分子診斷試劑盒中所述的一對引物 P1和P2是根據(jù)海豚鏈球菌基因組中一段保守區(qū)序列設計的，其 DNA序列分別如下：

P1(5’GAAAATAGGAAAGAGACGCAGTGTC3’)

P2(5’CCTTATTTCCAGTCTTTCGACCTTC3’)

用本發(fā)明上述試劑盒檢測魚類病原菌海豚鏈球菌的方法，按下 列步驟進行：