[發明專利]兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業制備方法

有效

• 申請號: 200810219862.8
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101434936A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 宋秋蘭
• 申請（專利權）人: 宋秋蘭
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00
• 代理公司: 廣州三環專利代理有限公司
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

技術領域

本發明涉及兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶，尤其涉及兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業制備方法。

背景技術

幾丁質(Chitin)是一種以β-1，4糖苷鍵連接的N-乙酰葡萄糖胺(N-actylglucosamine，GlcNAc)，為生物多糖，是真菌細胞壁、非脊椎動物如昆蟲、線蟲的外骨骼的重要結構成份。幾丁質結合蛋白(Chitin-bindingproteins，CBPs)是一類能與幾丁質(Chitin)特異結合的蛋白質，廣泛存在于動、植物中，是動、植物防御細菌和真菌感染的天然防衛體系的的組要成員，在動、植物受到傷害時、病蟲害侵染時大量表達。

溶菌酶能催化水解構成細胞壁的N-乙酰葡萄糖胺(和N-乙酰胞壁酸(N-acetyl?muramic?acid，NAM)之間的β-1，4糖苷鍵，也能水解幾丁質N-乙酰胞壁酸之間的β-1，4糖苷鍵，生成粘多糖、粘多肽、N-乙酰葡萄糖胺等生物小分子。在動、植物、微生物中都有存在。其用途廣泛，在食品工業上，溶菌酶是雙歧桿菌的增值因子，用于乳制品中，可防止腸炎和變態反應，對嬰、幼兒的腸道菌群有平衡作用；在干酪中添加溶菌酶可抑制丁酸菌的污染；在海鮮、肉制品中，溶菌酶與氯化鈉和亞硝酸鹽一起應用可延長肉制品的保質期，增強其防腐效果；在醫藥上，溶菌酶參與人體的多糖代謝，加速粘膜組織的修復，并具有抗感染、抗細菌、抗病毒的作用；溶菌酶還能分解粘膜蛋白，降解膿液或痰液的粘度，使之變稀而排出；還能與血液中的抗凝因子結合，具有止血作用等。

蘿卜雙功能酶兼具幾丁質酶和溶菌酶活力，酶穩定性高，酶活力在0～60℃，pH?3.4～10.0穩定；抑菌譜廣，對革蘭氏陰性細菌(G^-)、革蘭氏陽性細菌(G⁺)、真菌、昆蟲等都由一定的殺滅作用。(蘿卜CBPs的分離及部分酶學特性研究。賴曉芳，深善瑞，王煒軍。淮海工業院學報，第12卷第四期，47～50頁；中國專利CN02115151.2)。其作用機理是直接作用于靶標的細胞壁，使細胞壁降解、破裂，進而殺死靶標，對動、植物無毒副作用，也不會產生耐藥性；而目前使用的抗生素類藥物主要是通過阻斷細菌的復制繁殖，動、植物會產生嚴重的耐藥性，對動、植物危害很大。

目前，這類酶制劑(如雞蛋清溶菌酶)的生產制備多用等電點沉淀法即原料(蛋清)稀釋，加入5％NaCl，調節pH值至等電點(pI)，加入晶種，離心收集。此工藝的缺陷是：等電點時，酶沉淀不完全，還有部分酶處于溶解狀態，產率低，二是：等電點時，酶變性失活，損傷了酶的活力。也可采用離子交換樹脂吸附法，但是，由于樹脂的疏水性，易引起蛋白變性，而且，雜蛋白多，酶的純度不高。

兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶的性質為其在生產、生活中應用提供了基礎。目前，可用于防治動、植物真菌感染的植物來源的工業產酶極少，如何實現兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶的工業化生產是限制兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶推廣應用和產品開發的瓶頸。

發明內容

本發明的目的是提供一種兼具幾丁質酶和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業提取方法。該法操作工藝簡單，陳本低廉，所得蘿卜雙功能酶酶活力高，抗菌譜廣，穩定性好，半衰期長，可用于醫藥，衛生保健、農藥等領域。

本發明是通過如下技術方案實現的：一種兼具幾丁質酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業制備方法，其特征在于，先將原料洗凈，切碎，用勻漿液攪拌勻漿，通過離心，過濾，超過濾等步驟獲得蘿卜雙功能酶濃縮液，濃縮液分別加入保護劑，噴霧干燥后制得干粉蘿卜雙功能酶，包含以下步驟：

(1)原料處理：取新鮮蘿卜葉或塊根洗凈；

(2)勻漿提取：取(1)所得原料，加入原料體積1～2倍的4℃預冷的勻漿液攪拌勻漿；

(3)離心：將(2)所述勻漿過濾，保存濾渣，取濾液，在室溫下，12000r/min離心，收集上清液I；

(4)過濾：取上述上清液I，用200目二層尼龍布過濾，收集濾液；

(5)再離心：取(5)所得濾液，常溫下，14000r/min離心，收集上清液III；

(6)超過濾：排阻相對分子量10000和60000的蛋白質，截留相對分子量10000～60000的蛋白質，得濃縮液；

(7-1)蘿卜雙功能酶I：取(7)所得濃縮液，加入保護劑，噴霧干燥，進風溫度185℃～195℃，出口溫度80℃～85℃，獲得噴霧干燥粉即為蘿卜雙功能酶I。

較佳地，所述的兼具幾丁質酶活力和溶菌酶活力的蘿卜雙功能酶工業制備方法，還包括如下任意步驟：