[發明專利]一種石斑魚幾丁質酶A基因、含有該基因的表達載體、重組株及其應用

無效

• 申請號: 200810219820.4
• 申請日: 2008-12-09
• 公開（公告）號: CN101423839A
• 公開（公告）日: 2009-05-06
• 發明（設計）人: 李文笙;馮少珍;林浩然
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/42;C12N15/70;C12N15/81;C12N1/21;C12N1/19;C07K19/00;A23K1/165;C12R1/19;C12R1/84
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 陳 衛

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種石斑魚幾丁質酶A基因、含有該基因的表達載體、重組株以及該石斑魚幾丁質酶A基因在制備融合蛋白、魚飼料添加劑中的應用。

背景技術

幾丁質酶(chitinase，CHI)是一種水解多聚糖酶，它切斷幾丁質的β(1-4)N-乙酰-D-葡萄糖單位，其氨基酸序列特征是含有必備的幾個保守區域包括：glyco-18區域(含有活性位點)、幾丁質結合區域和一個鉸鏈區域。

幾丁質酶廣泛存在于生物界，是自然界中第二豐富的多糖。在細菌、真菌和植物中已經發現多種幾丁質酶，并且很多已經用于轉基因方面的研究。昆蟲、甲殼動物、兩棲動物和脊椎動物也發現有幾丁質酶。

根據其組織分布和分子生物學研究，已經發現的脊椎動物幾丁質酶基因分為三類：巨嗜細胞特異性幾丁質酶，酸性幾丁質酶和胰腺特異性幾丁質酶。酸性幾丁質酶基因含有一個絲氨酸和甘氨酸重復序列；胰腺特異性幾丁質酶基因在催化的glyco-18和幾丁質結合區之間含有一個蘇氨酸重復序列；而巨嗜細胞特異性幾丁質酶基因沒有明顯的重復序列。

魚類自身含有幾丁質酶基因，能夠合成幾丁質酶。目前已獲得比目魚3個幾丁質酶全長cDNA序列，以及斑馬魚、虹鱒、黑青斑河豚、棘魚和青鯰的幾丁質酶相關ESTs序列。目前研究結果推斷幾丁質酶與魚類的消化生理和非特異性免疫有著密切的關系。

石斑魚是海洋珊瑚礁魚類，屬鮨科(Serranidae)，石斑魚屬(Epinephelus)，在我國分布有30多種。石斑魚是一種名貴的海水魚類，具有極高的經濟價值。

石斑魚的苗種培育是養殖生產持續發展的關鍵，但目前在石斑魚人工養殖中還沒有一種能有效促進其苗種消化、生長和提高魚苗免疫功能的餌料添加劑。

發明內容

本發明的目的在于提供一種石斑魚幾丁質酶A基因。

本發明的另一個目的在于提供含有該基因的表達載體。

本發明的另一個目的在于提供上述載體轉化的重組株。

本發明的另一個目的在于提供上述石斑魚幾丁質酶A基因在制備融合蛋白、魚飼料添加劑中的應用。

本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的：

一種石斑魚幾丁質酶A基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，長度為1658bp，其中第53—1483位核苷酸是石斑魚幾丁質酶A基因成熟肽序列，編碼456個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，1484—1486位核苷酸是終止子序列TAA。

上述石斑魚幾丁質酶A基因全長序列的獲得是采用目前基因工程領域中常用的一種可快速、經濟、有效地獲得基因全長序列的方法，即先得到基因相關的ESTs(表達序列標簽)序列，繼而獲得基因全長片段。具體步驟如下：

(1)構建石斑魚胃cDNA文庫，隨即挑取大量克隆進行測序獲得ESTs序列，通過Genebank?Blastx同源檢索，得到和幾丁質酶基因相關的ESTs序列；這里石斑魚胃cDNA文庫的構建可以采用CloneMiner?cDNA文庫構建試劑盒，如Invitrogen公司的CloneMiner?cDNA?Library?Construction?Kit；

(2)結合5’RACE方法，對上述得到的幾丁質酶基因相關的ESTs序列進行組裝、拼接得到石斑魚幾丁質酶基因全長cDNA序列，并將該序列命名為石斑魚幾丁質酶A基因，對該序列進行測序、氨基酸序列分析以及同源比對等。

核酸測序結果如SEQ?ID?NO：1所示，長度為1658bp，該核苷酸序列的第53—1483位核苷酸編碼456個氨基酸，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，氨基酸序列分析表明這456個氨基酸的肽鏈為石斑魚幾丁質酶A成熟肽，該成熟肽是石斑魚幾丁質酶A前體的一個片段，幾丁質酶A前體在加工過程中經切除信號肽后產生這一片段，該成熟肽包括glyco-18區域、活性位點、2型幾丁質結合區域和一個鉸鏈區域，具有消化幾丁質等生物活性。該成熟肽沒有脊椎動物酸性幾丁質酶的特征性序列或者胰腺特異性幾丁質酶的特征性蘇氨酸重復序列，但含有頡氨酸、天冬酰胺和脯氨酸重復序列。結合上述石斑魚幾丁質酶A成熟肽的特點以及同源比對結果，可以得出本發明得到的石斑魚幾丁質酶A基因為一個新基因。

本發明還構建了含有上述石斑魚幾丁質酶A基因的表達載體。表達載體的構建方法是常規方法，將石斑魚幾丁質酶A基因經酶切和分離純化后，接入到已有載體的相應酶切位點之間，即構建成所需的含有石斑魚幾丁質酶A基因的表達載體。