[發明專利]1-氨基海因衍生物半抗原、抗原和抗體的制備方法

有效

• 申請號: 200810219296.0
• 申請日: 2008-11-21
• 公開（公告）號: CN101412697A
• 公開（公告）日: 2009-04-22
• 發明（設計）人: 沈玉棟;張世偉;孫遠明;雷紅濤;王弘;肖治理;楊金易;蔡肇婷
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07D233/80
• 分類號: C07D233/80;C07K14/765;C07K16/44;C07K16/06;G01N33/53
• 代理公司: 廣州粵高專利代理有限公司
• 代理人: 林麗明;任 重

技術領域

本發明屬于免疫化學技術領域，具體涉及一種1-氨基海因衍生物的半抗原、抗原和抗體及其制備方法及制備得到的半抗原、抗原和抗體和抗體的應用。?

背景技術

呋喃妥因是一種廣譜抗菌藥物，對革蘭陽性及陰性菌均有一定抗菌作用，并且對豬、魚等肉源性動物具有生長促進作用。通過長期的研究發現，呋喃妥因及其代謝物具有致癌作用，因此多國禁止用于肉源性動物的養殖中。自1995年起歐盟全面規定禁止使用呋喃妥因，在動物源性食品中呋喃類殘留物的檢出限為不得檢出。我國也規定把呋喃妥因列為動物養殖中的禁藥。但因為其廉價且增產效果顯著，近年來濫用現象時有發生。因為呋喃妥因原藥分子在體內很快就代謝，而蛋白結合態代謝產物能在組織中存留較長時間，所以在分析此類藥物的殘留時必須分析其代謝后的產物：1-氨基海因(AHD)。?

測定動物源性食品中的AHD殘留量，目前國內外報道的檢測方法主要為儀器法，例如液-質聯用(LC-MS)和高效液相-質譜聯用法(HPLC-MS)。但儀器法具有成本高，前處理煩瑣，操作復雜等缺點。ELISA方法因其能彌補儀器法的上述缺點，被廣泛運用于農獸藥殘留的檢測。?

大多數藥物、毒素、環境污染物分子質量小于1000u，屬于僅有?反應原性而無免疫原性的半抗原。目前制備小分子半抗原抗體的常規方法為：選擇具有毒理學意義的代謝產物或原形藥物作為待測物，設計合成保留待測物分子結構特征并帶有活性基團的半抗原，通過共價鍵使半抗原與大分子蛋白質載體偶聯，制備人工免疫原。經動物免疫，抗血清的純化等程序得到可用于ELISA檢測的抗體。理論上制備所有原形藥物的小分子半抗原抗體都可以實現，但也需要具體的、特定的技術方案才能實現按目標藥物的特異性抗體的制備，目前尚無可用于ELISA檢測的1-氨基海因半抗原、抗原和抗體的相關報道，使得1-氨基海因ELISA檢測方法暫時還未建立。?

發明內容

本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種氨基脲衍生物半抗原，同時提供由所述半抗原偶連載體蛋白制備的人工抗原，以及免疫實驗動物后使機體產生特異的針對氨基脲衍生物的抗體。?

本發明的另一個目的是提供所述半抗原、抗原和特異性抗體的制備方法。?

本發明的目的通過以下技術方案來予以實現：?

提供一種1-氨基海因衍生物半抗原的制備方法，是將氨基脲與過量的帶羧基的苯甲醛衍生物在室溫條件下于甲醇中進行氨醛縮合反應，反應產生的沉淀經洗滌、干燥得到所述半抗原。氨醛縮合反應時間為過夜，大約16個小時。?

所述帶羧基的苯甲醛衍生物優選間羧基苯甲醛或2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸。

帶羧基的苯甲醛衍生物采用間羧基苯甲醛制備得到的1-氨基海因衍生物半抗原具有式(I)所示結構：?

帶羧基的苯甲醛衍生物采用2-(4-甲酰基苯氧基)乙酸制備得到的1-氨基海因衍生物半抗原具有式(II)所示結構：?

本發明提供了一種1-氨基海因衍生物抗原的制備方法，包括以下步驟：?

(1)將1-氨基海因衍生物半抗原與縮合劑N，N’-二環己基碳二亞胺(DCC)和N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)反應形成活潑酯；?

(2)將活潑酯滴加入蛋白溶液中反應；?

(3)步驟(2)反應得到的偶聯有氨基脲衍生物半抗原的蛋白經透析純化得到目標抗原。?

步驟(1)所述反應時間過夜；?

步驟(2)所述蛋白溶液的濃度為5mg/mL，反應時間為12小時；?

步驟(3)所述的透析純化時間為3天。

選用式(I)所示半抗原制備得到的抗原具有式(III)所示結構：?

選用式(II)所示半抗原制備得到的抗原具有式(IV)所示結構：?

本發明同時提供了一種1-氨基海因衍生物抗體的制備方法，包括以下步驟：?

(a)將1-氨基海因衍生物抗原與弗氏佐劑免疫實驗動物；?

(b)免疫后抽取血液，分離血清；?

(c)血清經辛酸硫酸銨純化得到抗體。?

步驟(a)所述1-氨基海因衍生物抗原濃度為1mg/mL，氨基脲衍生物抗原與弗氏佐劑按1：1比例免疫實驗動物。?

步驟(b)所述免疫次數為4次。?