[發明專利]針對CDK2基因siRNA重組體189的構建及用途

無效

• 申請號: 200810209711.4
• 申請日: 2008-12-16
• 公開（公告）號: CN101775393A
• 公開（公告）日: 2010-07-14
• 發明（設計）人: 于英君;宋高臣;于水瀾;李和偉;趙陽;李娜;李玲
• 申請（專利權）人: 于英君;宋高臣;于水瀾
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/79;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種RNAi重組質粒的構建及其在腫瘤基因治療中的應用。

背景技術

RNA干擾(RNA?interference，簡稱RNAi)技術是近幾年發展起來的一種抑制靶基因表達的新方法，它被認為從低等生物到高等生物都普遍存在的一種防御外源性核酸侵擾的生理機制。RNAi是通過小分子雙鏈RNA特異性互補靶向基因轉錄本，從而誘導基因轉錄后沉默的一種技術。人工合成或細胞內轉錄生成的小的雙鏈RNA(siRNA)或者發夾型RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)進入細胞后，能和與之互補的靶基因mRNA結合，從而介導特異性的切割酶將mRNA降解，達到降低目的基因表達的目的。

目前RNAi技術已經廣泛用于基因功能、信號轉導通路方法以及腫瘤基因治療的研究領域。其在腫瘤基因治療上與基因替代、反義寡核苷酸治療、細胞因子基因治療等傳統的基因治療方法相比，具有特異、高效、毒性小的特點，因此可用來對一些腫瘤進行治療。

腫瘤的產生是喪失細胞機能調控的結果。生長信號的異常和細胞周期調控的異常將導致細胞增殖的異常，最終產生惡性克隆。研究進展表明：腫瘤共性的生物學特征是失控性生長，其主要分子機制是細胞周期紊亂導致細胞增殖過多和凋亡過少。因此，可以說腫瘤是細胞失控性生長所致的一類細胞周期性疾病。CDK2是細胞周期調控的核心分子，正常情況下，CDK2在整個細胞周期中，保持非常恒定的水平，但是在細胞周期蛋白的調節下，它的活性會發生變化。如果細胞周期蛋白持續過表達或CDK2的抑制蛋白表達下調，CDK2在細胞周期中始終處于高活性狀態，細胞周期處于失控狀態，則細胞就無限增殖發生癌變。

基因上述研究，我們針對CDK2基因設計相應的序列，連接到質粒載體上，構建siRNA重組表達質粒，將其導入肝癌細胞內，在U6啟動子的作用下轉錄產生shRNA，通過這些shRNA來誘導RNAi，從而特異地抑制CDK2基因的過度表達。因此，RNAi重組質粒可用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。

發明內容

本發明的目的在于提供針對CDK2基因RNAi重組質粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA189及制備方法，為腫瘤基因治療提供新策略。

本發明的另一目的是提供新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。

本發明選定CDK2基因作用腫瘤治療靶點，根據人肝癌細胞CDK2基因(GenBank?Accession?Number：NM_001798)的序列，通過網絡在線工具(http://www.invitrogen.com/nupage)在線設計軟件設計siRNA189(序列為：5`GCACGTACGGAGTTGTGTACA?3`)。并構建含干擾片段的dsDNA，送生物公司合成，退火后克隆入質粒(pGPU6/GFP/Neo)，并用酶切鑒定與DNA測序技術進行篩選鑒定重組質粒；通過脂質體法轉染至肝癌細胞，在U6啟動子的作用下轉錄產生短發夾RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)，通過這些shRNA來誘導RNAi，經實時定量PCR與Western?blot檢測干擾重組質粒對CDK2基因mRNA與蛋白水平的抑制程度，為開發成為新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物提供實驗依據。

附圖說明

圖1pGPU6/GFP/Neo質粒圖譜

圖2pGPU6/GFP/Neo-siRNA189測序結果

圖3穩定轉染后肝癌細胞的熒光表達的檢測

圖4Western?blot檢測圖，其中1為pGPU6/GFP/Neo-NC組；2為pGPU6/GFP/Neo-siRNA189組

具體實施方式

以下通過具體實施例對本發明作進一步的說明，以下實例僅用于說明本發明，而不用于限定本發明的范圍。

實施例一：干擾序列的設計

根據人肝癌細胞CDK2基因(GenBank?Accession?Number：NM_001798)的序列，通過網絡在線工具(http://www.invitrogen.com/nupage)在線設計軟件設計siRNA189(序列為：5`GCACGTACGGAGTTGTGTACA?3`)；再設計一組無關序列作為陰性對照。

實施例二：重組質粒的構建

構建Oligo單鏈，在正義和反義鏈之間鏈接Loop環，然后在基本結構基礎上添加Bam?H?I內切酶與Bbs?I內切酶的酶切位點序列與轉錄終止序列，形成編碼特異地抑制CDK2基因表達的siRNA189的DNA片段：