[發(fā)明專利]針對(duì)CDK2基因siRNA重組體186的構(gòu)建及用途

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 200810209708.2
• 申請(qǐng)日: 2008-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101775390A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 宋高臣;于英君;李和偉;于水瀾;李玲;趙陽(yáng);李娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 宋高臣;于英君;李和偉
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/11
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/11;C12N15/79;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種RNAi重組質(zhì)粒的構(gòu)建及其在腫瘤基因治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA干擾(RNA?interference，簡(jiǎn)稱RNAi)技術(shù)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種抑制靶基因表達(dá)的新方法，它被認(rèn)為從低等生物到高等生物都普遍存在的一種防御外源性核酸侵?jǐn)_的生理機(jī)制。RNAi是通過(guò)小分子雙鏈RNA特異性互補(bǔ)靶向基因轉(zhuǎn)錄本，從而誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種技術(shù)。人工合成或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄生成的小的雙鏈RNA(siRNA)或者發(fā)夾型RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)進(jìn)入細(xì)胞后，能和與之互補(bǔ)的靶基因mRNA結(jié)合，從而介導(dǎo)特異性的切割酶將mRNA降解，達(dá)到降低目的基因表達(dá)的目的。

目前RNAi技術(shù)已經(jīng)廣泛用于基因功能、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方法以及腫瘤基因治療的研究領(lǐng)域。其在腫瘤基因治療上與基因替代、反義寡核苷酸治療、細(xì)胞因子基因治療等傳統(tǒng)的基因治療方法相比，具有特異、高效、毒性小的特點(diǎn)，因此可用來(lái)對(duì)一些腫瘤進(jìn)行治療。

腫瘤的產(chǎn)生是喪失細(xì)胞機(jī)能調(diào)控的結(jié)果。生長(zhǎng)信號(hào)的異常和細(xì)胞周期調(diào)控的異常將導(dǎo)致細(xì)胞增殖的異常，最終產(chǎn)生惡性克隆。研究進(jìn)展表明：腫瘤共性的生物學(xué)特征是失控性生長(zhǎng)，其主要分子機(jī)制是細(xì)胞周期紊亂導(dǎo)致細(xì)胞增殖過(guò)多和凋亡過(guò)少。因此，可以說(shuō)腫瘤是細(xì)胞失控性生長(zhǎng)所致的一類(lèi)細(xì)胞周期性疾病。CDK2是細(xì)胞周期調(diào)控的核心分子，正常情況下，CDK2在整個(gè)細(xì)胞周期中，保持非常恒定的水平，但是在細(xì)胞周期蛋白的調(diào)節(jié)下，它的活性會(huì)發(fā)生變化。如果細(xì)胞周期蛋白持續(xù)過(guò)表達(dá)或CDK2的抑制蛋白表達(dá)下調(diào)，CDK2在細(xì)胞周期中始終處于高活性狀態(tài)，細(xì)胞周期處于失控狀態(tài)，則細(xì)胞就無(wú)限增殖發(fā)生癌變。

基因上述研究，我們針對(duì)CDK2基因設(shè)計(jì)相應(yīng)的序列，連接到質(zhì)粒載體上，構(gòu)建siRNA重組表達(dá)質(zhì)粒，將其導(dǎo)入肝癌細(xì)胞內(nèi)，在U6啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生shRNA，通過(guò)這些shRNA來(lái)誘導(dǎo)RNAi，從而特異地抑制CDK2基因的過(guò)度表達(dá)。因此，RNAi重組質(zhì)粒可用于制備新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供針對(duì)CDK2基因RNAi重組質(zhì)粒pGPU6/GFP/Neo-siRNA186及制備方法，為腫瘤基因治療提供新策略。

本發(fā)明的另一目的是提供新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物。

本發(fā)明選定CDK2基因作用腫瘤治療靶點(diǎn)，根據(jù)人肝癌細(xì)胞CDK2基因(GenBank?Accession?Number：NM_001798)的序列，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://www.invitrogen.com/nupage)在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA186(序列為：5`GCCATCAAGCTAGCAGACTTT3`)。并構(gòu)建含干擾片段的dsDNA，送生物公司合成，退火后克隆入質(zhì)粒(pGPU6/GFP/Neo)，并用酶切鑒定與DNA測(cè)序技術(shù)進(jìn)行篩選鑒定重組質(zhì)粒；通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞，在U6啟動(dòng)子的作用下轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生短發(fā)夾RNA(short?hairpin?RNA，shRNA)，通過(guò)這些shRNA來(lái)誘導(dǎo)RNAi，經(jīng)實(shí)時(shí)定量PCR與Western?blot檢測(cè)干擾重組質(zhì)粒對(duì)CDK2基因mRNA與蛋白水平的抑制程度，為開(kāi)發(fā)成為新的抗腫瘤生物制劑和抗腫瘤基因藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒圖譜

圖2pGPU6/GFP/Neo-siRNA186測(cè)序結(jié)果

圖3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后肝癌細(xì)胞的熒光表達(dá)的檢測(cè)

圖4實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線

圖5Western?blot檢測(cè)圖，其中1為pGPU6/GFP/Neo-siRNA186組；2為pGPU6/GFP/Neo-NC組

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，以下實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限定本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例一：干擾序列的設(shè)計(jì)

根據(jù)人肝癌細(xì)胞CDK2基因(GenBank?Accession?Number：NM_001798)的序列，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)在線工具(http://www.invitrogen.com/nupage)在線設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)siRNA186(序列為：5`GCCATCAAGCTAGCAGACTTT3`)；再設(shè)計(jì)一組無(wú)關(guān)序列作為陰性對(duì)照。

實(shí)施例二：重組質(zhì)粒的構(gòu)建