[發明專利]CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態性的檢測方法

無效

• 申請號: 200810207776.5
• 申請日: 2008-12-25
• 公開（公告）號: CN101434994A
• 公開（公告）日: 2009-05-20
• 發明（設計）人: 秦勝營;賀林;熊玉宇;王鳴
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種基因工程技術領域的單核苷酸多態性的檢測方法，具體是一種CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態性的檢測方法。

背景技術

細胞色素氧化酶P450?2C9，即CYP2C9是細胞色素P450的一個成員。CYP2C9在人類肝微粒體內含量豐富，約占CYP450s總量的20％，僅次于CYP3A4。人類的CYP2C基因定位在染色體10q24.2。迄今為止，已分離出六個CYP2C的cDNAs，即CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18及CYP2C19。CYP2C9和CYP2C10僅有2個氨基酸的不同，且二者的催化活性極為相似，故一般常把CYP2C9和CYP2C10統稱為CYP2C9/10或CYP2C9。CYP2C9含有9個外顯子和8個內含子，全長約5.5kb。在CYP2C95’-上游2.2kb內含有幾個與糖皮質激素效應元件一致的序列，另外在起始密碼子上游57bp和110bp處分別有一個TATA和CAAT盒。在5’調控區至少存在7個SNPs，它們可能影響CYP2C9的轉錄，其中位于HNF-1(Hepatic?nuclear?factor-1)結合位點的T-1912C參與了基因轉錄的激活。另外，第一外顯子內的6bp重復也參與了基因表達的調控。若缺失從-155到0這段序列，基因轉錄水平會降低至正常狀態的1/7-1/8，這意味著可能有重要的未知調控元件位于該區間。CYP2C9編碼的酶蛋白分子量為53KDa，含有490個氨基酸。CYP2C9含有一個能被細胞色素b5識別并對其產生激活作用的位點，即Arg-Arg-Phe-Ser，經cAMP依賴性激酶進行絲氨酸殘基磷酸化修飾后能被細胞色素b5所識別，進而導致該酶的激活。臨床上約有10％的常用藥物由CYP2C9催化代謝，常見的底物有磺胺類、氨基比林(Antipyrin)、雙香豆素(Dicoumarol)、氯霉素(Chloramphenicol)、西米替丁(Cimetidine)、咪唑類抗真菌藥、甲苯磺丁脲(Tolbutamid)等。多數CYP2C9的單核苷酸突變可以影響基因的后續轉錄和表達，進而改變酶的結構和活性，這是造成個體差異的主要原因。鑒于CYP2C9在藥物代謝中的作用及活性存在個體差異，因此CYP2C9基因的多態性檢測是急需解決的技術問題。

經對現有技術文獻的檢索發現，未發現有CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態性(SNP)檢測方法的相關報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態性的檢測方法。本發明為藥物設計提供了基因學理論根據，同時也為基于藥物基因組學理念的新藥研發提供了指導依據。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明涉及的一種CYP2C9基因第九號外顯子單核苷酸多態性的檢測方法，其步驟具體為：

步驟一，以GenBank數據庫中CYP2C9基因第九號外顯子以及外顯子與內含子接合部位序列為模板設計一對等位基因特異性的核酸引物，利用引物對來擴增CYP2C9基因的第九號外顯子的DNA序列，對擴增產物進行分離純化，得到相應分離核酸；

步驟二，對分離核酸的CYP2C9基因第九號外顯子的第1739-1740位核苷酸進行檢測，確定其是否存在單核苷酸多態性，即兩個堿基AT的缺失。

步驟一中，所述一對等位基因特異性的核酸引物，該引物長度為15bp-50bp，且特異性地雜交并擴增出含人CYP2C9基因第九號外顯子的如序列表SEQ?IDNO.1所示序列的第1739-1740位的單核苷酸多態性的擴增產物。

步驟一中，所述分離核酸，該核酸具有序列表SEQ?ID?NO.2所示的序列。

步驟一中，所述分離純化具體為：在基因組DNA水平上，利用引物來擴增每個多態性位點的基因序列和利用純化試劑盒對擴增產物進行提純。

步驟二中，所述檢測，具體包括以下方法：DNA測序法、雜交測序法、酶促錯配切割法、異源雙鏈分析法、點雜交法、寡核苷酸陣列法、微測序法、Taqman技術、分子信標法、變性高效液相色譜法。

用于本發明的測試樣品中抽提出的DNA或mRNA。對于CYP2C9基因的第九號外顯子活性而言，可以是任何含有CYP2C9基因的第九號外顯子的樣品。