[發(fā)明專利]一種提高載體轉導和基因表達效率的病毒載體及其應用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810207206.6
• 申請日: 2008-12-18
• 公開（公告）號: CN101429524A
• 公開（公告）日: 2009-05-13
• 發(fā)明（設計）人: 鐘江;王鑫;李儷;尹雋
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/86
• 分類號: C12N15/86;C12N15/866;C12N15/67
• 代理公司: 上海東創(chuàng)專利代理事務所
• 代理人: 巫蓓麗

技術領域

本發(fā)明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種提高在動物細胞中轉導和表達外源基因效率的病毒載體及其應用方法。

背景技術

桿狀病毒是自然界存在的一類天然宿主主要為鱗翅目和鞘翅目昆蟲的病毒，長期以來被用作生物農藥來防治農林害蟲，也廣泛地用于在昆蟲細胞中生產蛋白質的基因工程表達載體。其模式種為苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa?californica?multicapsid?nucleopolyhedrovirus，簡稱AcMNPV)。

近年來，人們發(fā)現桿狀病毒同樣是一類優(yōu)良的在哺乳動物細胞中生產蛋白質的基因工程表達載體和基因治療及疫苗載體。目前已經證實該載體可以有效地轉導數十種各類來源的哺乳動物細胞，并讓目的基因在哺乳動物細胞中高效地表達(Cheng?T，Xu?CY，Wang?YB，Chen?M，Wu?T，Zhang?J，Xia?NS.2004.A?rapid?and?efficient?method?to?express?target?genes?in?mammalian?cells?bybaculovirus，World?J?Gastroenterol.10(11)：1612-1618；Hu?YC?2006.Baculovirus?vectors?for?gene?therapy.Adv?Virus?Res.；68：287-320.)。

桿狀病毒載體介導目的基因在哺乳動物細胞中表達的基本原理是：利用能被哺乳動物細胞識別的啟動子——如巨細胞病毒的IE啟動子(CMV)和勞氏瘤病毒的LTR啟動子等——控制目的基因，構成表達框。再將該表達框的DNA整合到病毒DNA骨架上，構建得到重組桿狀病毒；利用重組桿狀病毒可以進入多種哺乳動物細胞的特點將目的基因轉導入目的細胞系并表達。桿狀病毒-哺乳動物細胞表達載體的主要優(yōu)點包括：病毒遺傳背景清晰，基因容量大；能承載較大的目的基因；生物安全性好，天然情況下不感染人類，不在哺乳動物細胞中復制；容易擴大規(guī)模，達到生產要求；能夠轉導多種哺乳細胞等等(Hu?YC?2006.Baculovirus?vectors?for?gene?therapy.Adv?VirusRes.；68：287-320.；Kost?T.A.，Condreay?J.P.and?Jarvis?D.L.，2005.Baculovirus?asversatile?vectors?for?protein?expression?in?insect?and?mammalian?cells.Nat.Biotechnol.23，567-575)。但是，這一載體系統(tǒng)的缺點也比較明顯，如：對不同細胞的基因轉移效率不同，尤其是在常用的基因工程細胞株中國倉鼠卵巢細胞CHO中，基因轉移效率不理想，影響了其廣泛的應用。

細胞轉導肽是一類能夠攜帶生物大分子，包括蛋白質，DNA，甚至顆粒物進入細胞及亞細胞結構的多肽序列，又叫蛋白轉導結構域(Proteintransduction?domain，PTD)。其中最為著名的細胞轉導肽是1988年Green和Frankel各自獨立發(fā)現的人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白(Green?M，Loeweastein?PM.1988.Autonomous?functional?domain?of?chemicallysynthesized?human?immunodeficiency?virus?Tat?transactivator?protein.Cell，55：1179-1188；Frankel?AD，Pabo?CO.1988.Cellular?uptake?of?the?Tat?proteinfrom?human?immunodeficiency?virus.Cell，55：1189-1193)。進一步的研究發(fā)現，TAT蛋白47～57位氨基酸序列(YGRKKRRQRRR)即具有細胞轉導肽功能(Vives?E，Brodin?P，Lebieu?B.1997.A?truncated?HIV-1?Tat?basic?domainrapidly?tanslocates?through?the?plasma?membrane?and?accumulates?in?the?cellnucleus.J?Biol?Chem，272：16010-16017)。目前細胞轉導肽被廣泛應用于幫助生物大分子進入細胞，但是通過將細胞轉導肽展示在病毒核衣殼上以提高病毒介導的基因轉導和表達效率的技術尚未見報道。

發(fā)明內容

本發(fā)明目的之一是提供一種提高載體轉導和基因表達效率的病毒載體。