[發明專利]密紋薄芝種菌株或子實體特異分子標記及獲得方法與應用

有效

• 申請號: 200810204553.3
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101514367A
• 公開（公告）日: 2009-08-26
• 發明（設計）人: 唐傳紅;張勁松;唐慶九;蘇春麗;賈薇;楊焱;劉艷芳;郝瑞霞;周帥;馮娜;劉方
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種密紋薄芝種菌株或子實體的特異性分子標記，其特征在于：該標記是一種基 因SCAR分子標記，其PCR擴增引物對序列為5′cgtcgtaaagcgagtctcttc?3′和 5′ggtcataaagttgtcccagac?3′。

2.密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，包括步驟：

I.菌株或子實體基因組DNA的提取

(1)菌株基因組DNA的提取

將4-6℃的密紋薄芝菌種轉接到PDA斜面上，26-28℃培養活化，5-7天后轉接到馬鈴 薯葡萄糖培養液中，26-28振蕩培養10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA；

(2)子實體基因組DNA的提取

將子實體1-2g剪碎，用體積比為1∶2-3的95％V/V酒精和0.5mol/L?EDTA·Na₂混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000μL?pH?8.0?CNETS溶 液分裝于2ml離心管中，60-70℃保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是1％(m/V)CTAB、1mol/L NaCl、10m?mol/LEDTA、20m?mol/L?Tris-Cl、1％m/V?SDS；

II.密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、測序及序列比對

用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’； ITS4：5‘-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實體ITS片段；然后測序并比對各個靈芝屬種的代表性的序列；

III.特異性PCR引物的獲得

根據ITS序列的比對結果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結合位點，利用Primer? Premier5.0設計出特異性PCR引物對為5′cgtcgtaaagcgagtctcttc??3′和 5′ggtcataaagttgtcccagac?3′；

IV.用特異PCR擴增引物對對密紋薄芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴 增；

V.瓊脂糖凝膠電泳檢測。

3.根據權利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特 征在于：所述步驟I(1)中所述的LETS提取法：

①將凍干的菌絲20-30mg置于預冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，后迅速向研缽中加入 1000ml已配置好的LETS緩沖液，分裝于2個1.5ml的離心管中；

②向每個管中加入600-800μL的苯酚∶氯仿異∶戊醇PCI比例為25∶24∶1上下 顛倒，充分混勻，4-10℃16000g離心8-15分鐘；

③輕輕吸取上清于新的離心管中，加入500μL的PCI，4℃16000g離心8-15分鐘；

④重復步驟③，直到兩相的界面沒有雜質為止；

⑤取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20℃預冷的無水乙醇或95％乙醇，輕輕混勻， 置于-20℃冰箱中靜置5-10分鐘；

⑥取出，4℃16000g離心10-15分鐘；

⑦倒去上清，再向管中加入500μL預冷的70％V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉淀使其溶 解，靜置一會兒，4℃16000g離心10分鐘；

⑧重復步驟⑦1次；

⑨倒去上清，待管中酒精揮發后，加入適量體積的TE緩沖液pH8.0，按100mlTE緩沖液 加入2μL?1mg/ml的DNase-free?RNase；37℃溫浴1-2個小時；

⑩將獲得的基因組DNA經過ITS-PCR擴增后再通過1.0％瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質量是否滿足試驗需要。