[發明專利]紫芝種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應用

有效

• 申請號: 200810204547.8
• 申請日: 2008-12-12
• 公開（公告）號: CN101514361A
• 公開（公告）日: 2009-08-26
• 發明（設計）人: 唐傳紅;張勁松;唐慶九;楊焱;賈薇;劉艷芳;郝瑞霞;周帥;馮娜;劉方
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 上海泰能知識產權代理事務所
• 代理人: 黃志達;謝文凱

1.一種紫芝種菌株或子實體的特異性分子標記，其特征在于：該標記是一種基因SCAR 分子標記，是PCR擴增后為432bp的特異DNA片斷，其PCR擴增引物對序列為：

5’-tcaagaagcggagacg-3’和5’-gtgacgaccacaagagc-3’；

432bp的特異DNA片斷的序列為：

TCAAGAAGCGGAGACGCGTATGTATCCATTGTTCCGTCGAGTGCTACGGTGCGCTGACCCCGTCCTTC TCCAGCTGAACCGCGCACAGCGCGTCAAGATCGGCCGGTGACAGTAGAGTACAGAGGATGTCCTAAT GTCTCCGTTGGACCCCGCCGAGCACCCCGAGCTGTACACCTGCCTAGAACTCCGTAATCTACCGCTGA TTCCTCTCACCAGATTCTTTAATGTCATTCGTGCGATATAGTGGGAAACCGTGGCTGTTCTCGTAAAGC TCTCGGAGCGAGCTGCGAATTTTGTTGGCGCTCCGAAGGTGTCAATCTGGTGCGTGCCGCCATTACGT CCCCTGGGGGAGTTCTTCTATTGTCGAACGTTTGTGGCTAGGAGGTCATACCTTTCCTCCAACGCCTAA TACCGCGCTCTTGTGGTCGTCAC。

2.紫芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，包括步驟：

I.菌株或子實體基因組DNA的提取

（1）菌株基因組DNA的提取

將4-6℃的紫芝菌種轉接到PDA斜面上，26-28℃培養活化，5-7天后轉接到馬鈴薯葡萄糖 培養液中，26-28振蕩培養10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA；

（2）子實體基因組DNA的提取

將子實體1-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95%V/V酒精和0.5mol/L?EDTA·Na₂混合物浸 泡處理20-30小時，過濾，水沖洗，研磨粉碎后，加入800-1000μL?pH?8.0CNETS溶液分裝于 2ml離心管中，60-70℃保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min后，取上清，按照酚/氯仿法 提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是1%(m/V)CTAB、1mol/L?NaCl、10m?mol/L EDTA、20m?mol/L?Tris-Cl、1%m/V?SDS；

II.紫芝種菌株或子實體特異DNA片段的獲得

用ISSR-PCR法，其中ISSR引物為5′GAAGAAGAAGAAGAAGAA3′，得到紫芝種菌 株或子實體特異DNA片段；

III.特異性PCR引物的獲得

以上述得到的特異性DNA片段的序列為基礎，設計特異PCR擴增引物對為：

5’-tcaagaagcggagacg-3’和5’-gtgacgaccacaagagc-3’；

IV.用特異PCR擴增引物對對紫芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴增

V.瓊脂糖凝膠電泳檢測。