[發(fā)明專利]miRNA在預(yù)測早期原發(fā)性肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)的應(yīng)用及其試劑盒

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 200810204363.1
• 申請日: 2008-12-10
• 公開（公告）號: CN101418343A
• 公開（公告）日: 2009-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙越;欽倫秀;周海軍;董瓊珠;賈戶亮
• 申請（專利權(quán)）人: 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院;復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海申匯專利代理有限公司
• 代理人: 翁若瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測早期原發(fā)性肝癌病人術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的試劑盒，屬于生物醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域。

背景技術(shù)

肝癌是我國第二大癌癥死因，根治性手術(shù)是目前主要治療手段。部分肝癌病人因早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期綜合治療而獲得長期生存。然而肝癌根治性切除后5年轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)率為61.5％，即使小肝癌也達(dá)43.5％，肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)已成為進(jìn)一步提高肝癌治療效果的最主要障礙。若能對肝癌早期患者術(shù)后進(jìn)行轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)測，及時給予干預(yù)治療，有利于提高患者生存率，具有一定的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。目前臨床尚無足夠敏感和特異的預(yù)測指標(biāo)來預(yù)測肝癌患者術(shù)后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的情況，甲胎蛋白、腫瘤大小，包膜有無等雖與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)有關(guān)但總體來說其預(yù)測準(zhǔn)確率還很低。近年來研究表明微小RNA(microRNA，miRNA)作為一類新型調(diào)節(jié)因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。應(yīng)用基因芯片或?qū)崟r定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)對miRNA表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)miRNAs可有助于多種癌癥的分型和預(yù)后判斷。腫瘤及其轉(zhuǎn)移特異相關(guān)的miRNAs的鑒定和其表達(dá)閾值的確定屬于腫瘤分子標(biāo)記物預(yù)測診斷的應(yīng)用范疇。早期肝癌病人如能對其術(shù)后復(fù)發(fā)情況進(jìn)行早診預(yù)測，采取適當(dāng)?shù)母深A(yù)治療，將十分有利于改善其預(yù)后生存。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種試劑盒，用于預(yù)測早期原發(fā)性肝癌病人術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于預(yù)測早期原發(fā)性肝癌病人術(shù)后肝癌復(fù)發(fā)的試劑盒，其特征在于，由反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)、擴(kuò)增系統(tǒng)和引物探針系統(tǒng)組成，其中，反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)由反轉(zhuǎn)錄酶、反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成，擴(kuò)增系統(tǒng)由含Taq酶的miRNA表達(dá)定量檢測混合液組成，引物探針系統(tǒng)由has-miR-34a莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物、has-miR-34a擴(kuò)增引物、has-miR-34a熒光標(biāo)記探針、RNU6B莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物、RNU6B擴(kuò)增引物和RNU6B熒光標(biāo)記探針組成。

本發(fā)明通過以下方法證明確定了has-miR-34a為早期原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物：

1、組織總RNA的抽提和純化：

收集91例在復(fù)旦大學(xué)肝癌研究所進(jìn)行腫瘤根治性切除手術(shù)原發(fā)性肝癌病人進(jìn)行研究。將冰凍的肝癌及癌周組織放于液氮中，砸成粉末狀，應(yīng)用Ambion公司mirVana^TMmiRNA分離試劑盒，提取組織中富含小分子RNA(≤200bp)的總RNA。使用DU800紫外分光光度計測定RNA的A260值(波長為260納米的吸光度值)和A260/A280的比值(1.9-2.1)，以評估其濃度和質(zhì)量，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。符合定量檢測要求的樣本置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、has-miR-34a?cDNA的合成：

將0.15μl?100mM脫氧核糖核苷酸混合物(dNTPs)，1.00μl?50U/μL反轉(zhuǎn)錄酶，1.50μl?10×反轉(zhuǎn)錄體系緩沖液，0.19μl?20U/μL?RNA酶抑制劑，4.16μl無核酸酶水，3.00μl?miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，和組織樣本模板RNA5.00μl(總量為50ng)充分混合均勻，冰上孵育5分鐘。miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序如下：16℃，30分鐘；42℃，30分鐘；85℃，5分鐘。所用試劑組分來源于MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(AppliedBiosystems公司，USA)。

3、has-miR-34a實時定量PCR的檢測

將1.00μl?has-miR-34a?20×擴(kuò)增引物和MGB(Minor?Groove?Binder，一種非熒光淬滅基團(tuán))標(biāo)記探針，與10.00μl基因表達(dá)定量檢測混合液(Geneexpression?master?mix，Applied?Biosystems公司，USA)混合，加入1：100稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物9μl。miRNA實時定量PCR反應(yīng)程序如下：95℃，10分鐘；95℃15秒；60℃，60秒(40個循環(huán))。實驗選取RNU6B為內(nèi)參，RNU6B的檢測使用與has-miR-34a相同的反轉(zhuǎn)錄和定量PCR反應(yīng)體系以及RNU6B的引物和探針系統(tǒng)。

4、has-miR-34a在早期原發(fā)性肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)情況分析：