[發明專利]蠶電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法

無效

• 申請號: 200810201959.6
• 申請日: 2008-10-30
• 公開（公告）號: CN101386853A
• 公開（公告）日: 2009-03-18
• 發明（設計）人: 宋紅生;沈欣;孫悅
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/10;C07K14/435
• 代理公司: 上海上大專利事務所（普通合伙）
• 代理人: 何文欣

技術領域

本發明涉及鱗翅目昆蟲家蠶(大造)的電壓門控鈉通道基因、編碼蛋白及其克隆方法。

背景技術

電壓門控鈉通道(VGSC)在神經元以及其它可興奮性細胞動作電位形成和傳導過程中扮演著極為重要的角色。當細胞膜去極化時，VGSC被電壓依賴性的激活，使胞外鈉離子選擇性通透進入胞內，形成動作電位的去極化相；VGSC在開放后幾個毫秒時段里就會失活，失活的VGSC需要回到靜息狀態后才能再開放(Catteral，1992)。VGSC的細微突變或變化，將影響生理功能的異常(Lai?et?al.，2003)。哺乳動物鈉通道基因亞型較多，如Nav1.1-Nav1.9和NavX，而昆蟲鈉通道基因的亞型相對較少，只發現2種亞型，即para基因和DSC基因。其中，僅para基因編碼的鈉通道在體外得以表達和功能鑒定，而DSC基因功能尚未得到鑒定(Goldin，2002)。目前已克隆和測序的昆蟲para直系同源鈉通道基因(para-orthologous?sodium?channel?gene)有果蠅(Drosophila?melanogaster)的para基因、家蠅(Musca?domestica)的Vsscl基因(也稱Msc基因)、煙草蚜蟲(Heliothis?virescens)的hscp基因、德國小蠊(Blattellagermanica)的para^CSMA基因、東亞鉗蝎(Buthus?martrensii)的BmNavl基因以及虎紋捕鳥蛛(Ornithoctonus?huwena)的OhNavl基因(Loughney?et?al.，1989；Ingles?et?al.，1996；Miyazaki?et?al.，1996；Park?et?al.，1999Zuo?et?al.，2002)。昆蟲鈉通道存在于包括感覺神經元在內的昆蟲神經系統，一般不表達在肌肉組織。細胞水平上的研究表明，昆蟲鈉通道在神經元的胞體與軸突上均有表達(Wicher?et?al.，2001)。

鈉通道呈現出的亞型多樣性，為理解鈉通道在生理/病理下的功能特性及其動態平衡調控帶來了復雜性，同時，也正在引發通道藥理與毒理基因組學研究的挑戰性。在神經系統中，各亞型的鈉通道通常共表達于同一個細胞上(例如DRG神經元)，為了闡明各亞型參與的生理活動，有必要將各通道介導的電流成分分離，但由于鈉通道各亞型介導的宏觀電流性質接近，單用不同刺激方式無法獲得單一電流；而體外表達雖可以獲得單一亞型的信息，但表達體系以及輔助亞基的存在與否都會對通道的性質產生重大影響，而且失去了通道在體內時的復雜環境，增加了對鈉離子通道認識的難度以及應用。例如，目前臨床上癲癇、神經病理性痛等的治療藥物通常以鈉通道為靶器，但由于其選擇性不高，可能產生嚴重的副作用；昆蟲鈉通道是DDT和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的主要作用靶點，但長期使用和濫用會導致昆蟲產生抗藥性，昆蟲的para鈉通道基因突變與抗藥性密切相關(Williamson?et?al.，1996；Soderlund?&?Knipple，2003)。因此，解析新型鈉通道亞型的基因編碼特征，不僅有利于各亞型生理功能的闡明與藥理價值的評估，同時也為鈉通道關聯的臨床疾病治療藥物以及高效生物殺蟲劑的研制提供理論的可行性和新分子先導物的開發。

發明內容

本發明的目的之一在于提供一種家蠶電壓門控鈉通道基因。

本發明的目的之二在于提供該電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白。

本發明的目的之三在于提供該電壓門控鈉通道基因的克隆方法。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種家蠶電壓門控鈉通道基因，其特征在于該基因具有下列核苷酸序列之一：

(1)具有SEQ?NO?1所示的DNA序列；

(2)與序列表中SEQ?NO?1限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的編碼蛋白，其特征在于該編碼蛋白具有序列表中SEQ?NO?2的氨基酸殘基序列或者是將SEQ?NO?1的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ?NO?1的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ?NO?1衍生的蛋白質。

一種上述的家蠶電壓門控鈉通道基因的克隆方法，其特征在于該方法的具體步驟為：

a.從家蠶的腦中提取總RNA；

b.用Superscript?II反轉錄酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA；