[發明專利]一種制備甲基萬古霉素的方法

有效

• 申請號: 200810201905.X
• 申請日: 2008-10-29
• 公開（公告）號: CN101724673A
• 公開（公告）日: 2010-06-09
• 發明（設計）人: 陳代杰;李航;黃鶴;魏維;阮林高;楊晟;朱麗;姜衛紅;戈梅;羅敏玉;楊志鈞;夏興;齊曉丹;王天嬌;殷瑜;楊天
• 申請（專利權）人: 上海來益生物藥物研究開發中心有限責任公司;浙江醫藥股份有限公司新昌制藥廠
• 主分類號: C12P21/02
• 分類號: C12P21/02;C12N15/54;C12N15/63;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海德昭知識產權代理有限公司 31204
• 代理人: 肖劍南

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及一種制備甲基萬古霉素(M43D) 的方法。

背景技術

甲基萬古霉素(M43D)是K.E.Merkel等1985年在東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalis?NRRL2450中作為萬古霉素的小組份而被發現的。如圖1所示，M43D是一種糖 肽類抗生素，結構與萬古霉素類似，在N端一位氨基酸的氮上比萬古霉素多一個甲基，對 革蘭氏陽性菌有較強的抗菌活性。

2000年，D.P.O’Brain等克隆了萬古霉素類似物chloroeremomycin的生物合成基因簇 中的N端甲基轉移酶，并以去甲萬古霉素，去甲萬古霉素七肽骨架等為底物進行催化反應。 在以去甲萬古霉素七肽骨架為底物的催化反應中，除了得到單甲基化的萬古霉素七肽骨架 外，還發現了少部分可能是雙甲基化的產物，但未繼續研究。而在以去甲萬古霉素為底物 的反應中，只發現了單甲基化的產物即萬古霉素，卻并未發現雙甲基化的產物。因此， M43D只能由Amycolatopsis?orientalis?NRRL2450菌株發酵所得，且M43D在該菌株的產 物中為小組分，難以大量制備。

在申請號為200710036861.5的中國發明專利申請中，本申請的發明人公開了萬古霉 素生物合成基因簇中的26個基因，其中的vcm12基因編碼N—甲基轉移酶。該酶主要負 責催化甲基轉移到萬古霉素七肽骨架的第一個氨基酸亮氨酸的N端氮原子上，是萬古霉素 生物合成途徑中的一個重要的后修飾酶。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種制備M43D的方法，以用于生產M43D。

本發明提供的制備M43D的方法為利用N甲基轉移酶催化去甲萬古霉素或萬古霉素 制備M43D。

根據本發明的一個優選實施例，本發明中使用的N甲基轉移酶通過發酵表達N甲基 轉移酶的菌株獲得。

進一步地，所述N甲基轉移酶由萬古霉素生物合成基因簇中編碼N—甲基轉移酶的 vcm12基因編碼；所述編碼N—甲基轉移酶的vcm12基因來源于東方擬無枝酸菌ATCC 43491。

本發明提供的M43D的制備方法，可用于工業化生產M43D。

附圖說明

圖1是M43D與萬古霉素的結構圖，其中，R＝CH₃，當R1＝H時，為萬古霉素；當 R1＝CH₃時，為M43D。

圖2是菌株E.coli?BL21(DE3)/pLYLH13誘導表達后的菌體的電泳檢測結果，其中， 泳道1是細胞破碎液沉淀的電泳結果，泳道2是細胞破碎液上清的電泳結果。

圖3是以去甲萬古霉素為底物的催化反應的HPLC檢測結果，其中，(1)是萬古霉素 標準品的HPLC檢測結果；(2)E.coli?BL21(DE3)/pLYLH13的粗酶液催化的反應的HPLC 檢測結果；(3)E.coli?BL21(DE3)/pET30a(+)的粗酶液催化的反應的HPLC檢測結果。

圖4是M43D的質譜檢測結果。

圖5是M43D的NMR檢測結果，其中，圖5a是M43D的H¹NMR圖譜，圖5b是 M43D的C¹³NMR圖譜。

圖6是以萬古霉素為底物的催化反應的HPLC檢測結果。

具體實施方式

以下結合具體實施例，對本發明作進一步說明。應理解，以下實施例僅用于說明本發 明而非用于限定本發明的范圍。

下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆：實驗 室手冊》(New?York：Cold?Spring?Harbor?Laboratory?Press，1989)中所述的條件進行。

本發明使用的菌株和質粒分別為：

pMD18-T?Simple?Vector，具有amp^R，購于TaKaRa公司。

pET30a(+)，具有T7promoter，T7teminater，kan^R，購于NOVAGEN。

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)，具有F^-ompT?hsdSB(r_B^-m_B^-)gal?dcm(DE3)，購于 NOVAGEN。